ЗАТВЕРДЖЕНО
наказом МОЗ України
від 30.05.1997 р. N 167
Інструкція
по організації та проведенню
протихолерних заходів, клініці та лабораторній діагностиці холери
4. Порядок дослідження.
При бактеріологічному дослідженні на холеру використовують різні поживні середовища: рідкі середовища збагачення, лужний агар, елективні, диференціально-діагностичні середовища і набір середовищ для ідентифікації.
Поживні середовища, діагностичні препарати, які використовуються для діагностики холери, повинні бути зареєстровані і дозволені до використання Комітетом по імунобіологічним препаратам МОЗ України.
Виготовлені в лабораторії поживні середовища, консерванти, інгібітори сторонньої мікрофлори, які використовуються для діагностики холери, підлягають бактеріологічному контролю.
Посіви досліджуваного матеріалу на різних етапах вирощуються при 37о C в 1 % пептонній воді з pH 7,8+/-0,2 - 6-8 годин, з pH 9,3+/-0,2 - не менше 14 годин, а в 1 % пептонній воді з телурітом калію - 12-18 годин, на лужному агарі - не менше 14-16 годин, на інших елективних середовищах - 18-24 години. pH основного пептону і 1 % пептонної води встановлюється тільки на іономірі. Використання індикаторних папірців не допускається.
Телуріт калію слід додавати в 1 % пептонну воду до внесення в неї досліджуваного матеріалу. Термін зберігання робочого розчину телуріту калію (1:1000) - 7 діб, а поживних середовищ з телурітом калію - не більше 2 діб при умові зберігання їх в холодильнику. Використання середовищ з консервантами допускається тільки один раз (1-е або 2-е середовище збагачення).
4.1. Дослідження матеріалу від людей (трупів).
I етап
а) випорожнення, блювотні маси, промивні води, жовч – від хворих; вміст кишечнику жовчного міхура і суспензію шматочків слизової кишечнику - від трупів засівають у 10-50 мл 1 % лептонної води;
б) при дослідженні нативного матеріалу від хворих з підозрою на холеру, трупного матеріалу:
- використовується тільки 1 % пептонна вода з pH 7,8+/-0,2;
- проводиться прямий посів на тверде елективне середовище;
- застосовуються експрес-методи дослідження: імунофлюоресцентний та реакція непрямої гемаглютинації (РНГА);
в) матеріал, що відібрано в 10-50 мл 1 % пептонної води (1-е середовище збагачення), інкубують при температурі 37о C в інфекційному відділенні і/або лабораторії 6-8 годин сумарно при pH 7,8+/-0,2; 14-20 годин при pH 9,3+/-0,2 (в вихідні і святкові дні до 48 годин);
г) матеріал, відібраний в 5 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2 (транспортне середовище), зберігається при кімнатній температурі не більше 24 годин, після надходження до лабораторії засівають в 50 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2 або 9,3+/-0,2 у повному об'ємі (1-е середовище збагачення).
II етап
Висів з 1-го середовища збагачення проводиться на лужний агар або інші елективні середовище і в 5-8 мл 2-го середовища збагачення. Пересіви в рідкі і на тверді середовища проводять з поверхні рідкого середовища великою бактеріологічною петлею діаметром 5 мм.
III етап
Висів з 2-го середовища збагачення проводять на лужний агар або інші елективні середовища через 5-6 годин при pH 7,8+/-0,2 і через 14-20 годин при pH 9,3+/-0,2.
IV етап
Відбір підозрілих на холерний вібріон колоній з твердих поживних середовищ проводиться через 16-24 години інкубації
посівів.
Переглядають чашки з посівами в проходячому світлі неозброєним оком, за допомогою лупи, під стереоскопічним мікроскопом в косопроходячому світлі і відбирають підозрілі колонії для виділення та ідентифікації.
Колонії холерних вібріонів в типовій S-формі на лужному агарі круглі, гладкі, плоскі, голубуваті, гомогенні з рівними краями, прозорі в проходячому світлі і сіро-голубі під стереоскопічним мікроскопом. Колонії на елективному середовищі TCBS мають яскраво жовте забарвлення на зеленому фоні середовища, напівпрозорі. На середовищі Монсур колонії без кольору, напівпрозорі з темним центром. Розміри колоній через 10-12 годин інкубації в основному не перевищують 1 мм; а до 18-24 годин інкубації досягають 2-3 мм в діаметрі.
В окремих випадках в посівах можуть також зустрічатися атипові колонії: мутні з щільним центром, пігментовані (коричневі або світло-жовті), дрібні, кокоподібні, шерехуваті.
При відборі колоній можна використовувати пробу на індофенолоксидазу з однокомпонентним реактивом (без альфа-нафтолу) або індикаторні паперці (СІП-1 - набір для ідентифікації вібріонів). Колонії відсівають негайно після появлення позитивної реакції. З колоніями, які виросли на елективних середовищах, не рекомендується ставити пробу на оксидазу.
Оксидазопозитивні колонії перевіряють в реакції аглютинації на склі (далі "слайд-аглютинація") з сироваткою холерною 01, RO в розведенні 1:100. При позитивній реакції і достатній кількості підозрілих колоній ставлять слайд-аглютинацію з варіантоспецифічними сироватками Інаба і Огава в розведенні 1:50, готують мазки для фарбування по Граму і оброблення люмінесцентною сироваткою.
Позитивна орієнтовна реакція аглютинації з холерною 01 або RO сироватками в розведенні 1:100 і варіантоспеціфічними в розведенні 1:50 або позитивна реакція з люмінісцентними антитілами в поєднанні з морфологічними, культуральними ознаками і специфічною імобілізацією дозволяють видати на відповідному етапі попередню відповідь про виявлення в досліджуваному матеріалі холерного вібріона 01.
Підозрілі на вібріони колонії, що аглютинуються і не аглютинуються холерними 01, RO сироватками, відсівають на одне із полівуглеводних середовищ (лактозо-сахарозне, Ресселя, Кліглера або ін.) і на сектор пластинки лужного агару для виділення чистої культури та її ідентифікації.
V етап
Ідентифікація. Відбирають культури з типовим для вібріонів характером росту на полівуглеводних середовищах:
- на двувуглеводних середовищах (лактозо-сахарозному, глюкозолактозному) спостерігається характерна для кислої реакції зміна кольору стовпчика при збереженні кольору скошеної частини без утворення газу;
- тривуглеводне середовище Кліглера повністю жовтіє без утворення газу і сірководню.
Культури, які виросли на лужному агарі, перевіряють на наявність індофенолоксидази. Визначають морфологію мікроорганізмів і чистоту відібраних по цих ознаках культур, які виросли на лужному агарі і полівуглеводних середовищах за допомогою мазків, пофарбованих по Граму.
Культури, які дали характерні зміни на полівуглеводних середовищах і позитивні в пробі на оксидазу, перевіряють в слайд-аглютинації з холерними сироватками 01, RO, Інаба і Огава. При негативних результатах з цими сироватками, ставлять слайд-аглютинацію з холерною сироваткою 0139. На основі позитивних результатів аглютинації з сироватками 01 серогрупи (01, Інаба, Огава) видають попередню або остаточну позитивну відповідь про виділення із досліджуваного матеріалу культури холерного вібріону 01 відповідного серовару.
Якщо виділена культура реагує з холерною сироваткою 0139 при негативних результатах з сироватками 01 серогрупи, видають відповідь про виділення холерного вібріону 0139 серогрупи. Проводять ідентифікацію виділених на полівуглеводних середовищах або на лужному агарі, які аглютинуються і не аглютинуються сироватками 01 і 0139 серогруп оксидаз опозитивних культур по скороченій або повній схемі.
VI етап
Враховують результати ідентифікації і видають остаточну відповідь про виділення культури холерного вібріону відповідної серогрупи: 01, RO (Інаба, Огава, Гікошима) або 0139 з зазначенням гемолітичної активності, чутливості до антибіотиків. Для культур холерних вібріонів 01 вказують належність до біовару.
При виділенні від хворого або вібріононосія культури холерного вібріону, яка не аглютинується з сироватками, видають відповідь про виділення холерних вібріонів не 01 (так званих НАГ-вібріонів). При наявності вібріонних аглютинуючих діагностичних сироваток визначають належність до інших серогруп.
4.2. Дослідження матеріалу з об'єктів довкілля.
Етапи дослідження об'єктів довкілля відрізняються від схеми дослідження матеріалу від хворих тільки на I етапі. II-VI етапи подані в розділі 4.1.
4.2.1. Вода поверхневих водоймищ, водопровідна і господарсько-побутові стічні води.
В залежності від часу доставки проби можливі варіанти посівів з метою первинного збагачення вібріонів:
а) до води, що досліджується, додають розчин основного пептону до 1 % концентрації.
Визначають pH, в випадку необхідності підлужують 10 % розчином їдкого натрію до pH 8,3+/-0,1. Аналіз проби (1 л) проводять у двох об'ємах по 500 мл. Час інкубації в таких об'ємах - 8-10 годин, II середовище збагачення -
в об'ємі 10 мл. Час інкубації в 1 % пептонній воді без телуріту калію pH 7,8+/-0,2 5-6 годин, з підвищенням лужністю або з телурітом калію - 14-20 годин.
б) в досліджувану воду (в двох об'ємах по 500 мл) додають розчин основного пептону до 1 % концентрації, встановлюють pH 9,3+/-0,2 або додають телуріт калію із робочого розведення 1:1000 до концентрації 1:100000 або 1:200000 у відповідності з даними перевірки, pH 8,3+/-0,1. Час інкубації 18-24 години; II середовище збагачення - 10 мл 1 % пептонної води, pH 7,8+/-0,2 без телуріту калію, час інкубації 6-8 годин.
в) після установлення лужної реакції і додання розчину основного пептону до 1 % концентрації проби зберігають при кімнатній температурі до ранку (1-е середовище збагачення). На початку наступного дня засівають 5 мл поверхневого шару в 100 мл 1 % пептонної води (II середовище збагачення) і роблять висів на лужний агар; висіви з II середовища збагачення через 6 годин інкубації.
г) воду фільтрують через мембранні фільтри N 2 або 3, змив з яких засівають в середовище збагачення та на агарові пластинки. Із змиву з фільтру можна робити мазки для фарбування холерною люмінісцентною сироваткою, а також ставити РНГА та інші реакції. При інтенсивному бактеріальному забрудненні проб можливе використання III середовища збагачення.
При заборі стічних вод марлевими тампонами останні кладуть в широкогорлі колби або банки з 1 % пептонною водою (500 мл).
4.2.2. Гідробіонти.
Жабу безпосередньо перед дослідженням знедвижують уколом голки в спинний мозок. Тварину фіксують за лапки на препарувальній дошці черевом догори. Поверхню живота обробляють спиртом, ножицями роблять медіальний розріз від анального отвору до грудної порожнини. Пінцетом беруть жовчний міхур, відсікають від печінки, розрізають стерильними ножицями і роблять відбиток на пластинці лужного агару. Решту жовчі разом з жовчним міхуром кладуть у флакони з 50-100 мл 1 % пептонної води (1-е середовище збагачення). Стерильними ножицями розрізають шлунок, вміст якого засівають в 1 % пептонну воду, а внутрішньою поверхнею стінки роблять відбитки на агарові пластинки. Посів матеріалу кишечнику роблять таким же чином, відсікаючи декілька петель ножицями в верхньому, середньому та нижньому відділах кишечнику.
У великих риб в тому ж порядку засівають в 1 % пептонну воду жабри, вміст жовчного міхура, шлунку, кишечника.
Дрібних риб (мальків) подрібнюють ножицями по 10-20 екз. в одній пробі і роблять посів суспензії петлею на чашку з агаром і в 1 % пептонну воду.
Дафній і рачків розтирають у ступці і засівають петлею в 1 % пептонну воду.
У раків досліджують кишечник, посів вмісту проводять в середовище збагачення, а з слизистої - відбиток на агарове середовище.
4.2.3. Харчові продукти.
4.2.3.1. Безалкогольні напої досліджують тим же методом, що і воду.
4.2.3.2. Молоко в кількості 5 мл засівають в 50-100 мл 1 % пептонної води або до 0,5 л молока додають основний розчин пептону до 1 % його концентрації. Інші молочні продукти (кефір, сметану, сир, морозиво та ін.) в кількості 5-10 мл засівають в 1 % пептонну воду.
4.2.3.3. Тверді харчові продукти подрібнюють і розтирають в ступці з фізіологічним розчином і засівають в кількості 10 г в 100 мл 1 % пептонної води та на агарові середовища.
4.2.3.4. Масло засівають в 1 % пептонну воду – рідке середовище збагачення в кількості 5-10 г, пом'якшивши його в термостаті, або проводять посів змиву з поверхні його кусків.
Після посіву продукту встановлюють pH середовища 8,3+/-0,1.
4.2.4. Змиви з об'єктів довкілля та мух засівають в 1 % пептонну воду і досліджують по звичайній схемі.
4.3. Ідентифікація культур холерних вібріонів.
4.3.1. Культури, виділені на різних етапах, ідентифікують з метою визначення їх належності до виду Vibrio cholerae відповідної серогрупи (01, 0139 або інших).
4.3.2. До виду V.cholerae відносять грамнегативні, аспорогенні, поліморфні палички, злегка зігнуті або прямі, активно рухливі, з одним полярно розташованим джгутиком, які утворюють індофенолоксидазу, ферментують глюкозу в аеробних і анаеробних умовах до кислоти (без газу), декарбоксилізують: лізин і орнітин, але не мають дигідролази аргініну, відносяться до 1-ї (рідше до 2-ї) ферментативної групи по Хейбергу. Таксономічне положення холерних вібріонів і ознаки, які відрізняють їх від родинних мікроорганізмів, наведені в таблицях 5-7.
4.3.3. Збудниками холери є V.cholerae серогрупи 01 (біоварів холери ельтор; сероварів Інаба, Огава і Гікошима) і 0139 серогрупи.
4.3.4. Токсигенні (які містять ген холерного токсину - vct+/-) варіанти холерних вібріонів 01 і 0139 серогруп викликають
захворювання холерою, які схильні до широкого епідемічного розповсюдження.
Схема лабораторного дослідження на холеру (див. малюнок 1)
Умовні позначення:
I та II - середовища збагачення;
ЛА – лужниний агар;
ЕС - елективне середовище;
ОП – оксизазна проба;
ОРА - орієнтовна реакція аглютинації;
АГ - аглютинація;
Ф-П - рекція Фогес-Проскауера на визначення ацетиметилкарбінолу;
ж – у випадку застосування для відбору колоній ПВС або ЛА;
ПВС - полівуглеводне середовище
Таксономія вібріонів
по Bergey's manual of systematic Bacteriology, 1984
та додатковими даними із публікацій після 1984 р.
-----------------------
|Родина Vibrionaceae |
|Shewan a. Veron, 1965|
-----------------------
Інші роди:
- Aeromonas Kluyver
et van Niel, 1936
- Plesiomonas
Habs et Shubert, 1962
- Photobacterium
----------------------- Beijerinck, 1889
| Типовий рід | - Lucibacterium
| Vibrio Pacini, 1854 | Hendrie, Hodgkiss et
----------------------- Shtwan, 1970
-----------------------
Інші види патогенних |Типовий вид Vibrio | V.cholerae non 01:-02
для людини вібріонів:|cholerae Pacini, 1854| - 0139 ...
----------------------- (по міжнародній
V. alginolyticus класифікації)
V. anguillarum** - 02 - 084 ,,,
V. cincinnatiensis* (по класифікації
V. carcharia* V. cholerae 01 Рос.НДПЧІ "Микроб"
V. damsela** і Ростовського в/Д
V. fluvialis серовари: біовари: НДПЧІ)***
V. furnisii V.cholerae V.cholerae
V. hollisae Inaba cholerae
V. mimicus V.cholerae (класич-
V. metschnikovii Ogava ний)
V. orientalis V.cholerae V.cholerae
V. parahaemolyticus Hikojima eltor
V. salmonicida* (ельтор)
V. vulnificus
Примітка: * - Запропоновані після видання Bergey'e manual of
Ystematic Bacteriology, 1984;
** - Запропоновані Mcdonell M.T. a. Colwell R.R.,
1985 віднести до нового роду Zistonella;
***- Типові штами 02-039, крім 012, 023 і 026, від-
повідають Sakazaki R., 1970, 040-083 не
вивчені в порівнянні з міжнародною колекціїю;
084 відповідає 0139 серогрупі.
4.3.5. Нетоксигенні (які не містять ген холерного токсину vct-) варіанти холерних вібріонів 01 та інших серогруп можуть викликати спорадичні (поодинокі) або групові захворювання (при спільному джерелі інфікування), які не схильні до широкого епідемічного розповсюдження.
4.3.6. Попередню ідентифікацію проводять по комплексу ознак, включаючи морфологію колоній, морфологію і рухливість мікробних клітин, пробу на оксидазу і аглютинацію на склі (слайд-аглютинація) з сироватками 01 (1:100), RO (1:50) і 0139 (в розведенні, відповідно позначенню на етикетці). Для культур, які позитивно реагують з сироваткою 01, RO, встановлюють належність до серологічного варіанту (Інаба і Огава) також в слайд-аглютинації.
4.3.7. Остаточну ідентифікацію виділених на полівуглеводному середовищі або лужному агарі культур, які аглютинуються на склі, проводять по скороченій або повній схемі.
4.3.7.1. Скорочена ідентифікація передбачає вивчення культури в розгорнутій реакції аглютинації з холерними сироватками 01, Інаба, Огава і RO, визначення чутливості до діагностичних монофагів належність до біохімічної групи Хейберга. Культури, які аглютинуються не менше ніж до 1/2 титра сироватками 01 і однією із варіантоспецифічних сироваток, відносяться до V.cholerae 01 серовара Огава або Інаба. Культури, які аглютинуються сироватками обох сероварів не менше 1/2 титра, відносять до серовару Гікошима. Для підтвердження виділеної культури холерних вібріонів до 0139 серогрупи досить позитивного результату в слайд-аглютинації з відповідною сироваткою.
4.3.7.2. При проведенні масових досліджень у вогнищі захворювання холерою, коли перші культури холерних вібріонів вже були ідентифіковані, позитивні результати тестування в слайд-аглютинації з холерними сироватками 01 або 0139 серогруп у поєднанні з морфологією і рухомістю клітин культур, виділених від хворих діареями або при обслідуванні на вібріоносійство, слід вважати остаточними для вирішення питання про проведення протиепідемічних заходів. Виділені культури передають для повної ідентифікації у визначену для цієї мети групу або лабораторію, фахівці якої при необхідності вносять у відповідь потрібні корективи і доповнення.
4.3.7.3. Повна ідентифікація культур, які аглютинуються холерними сироватками 01 серогрупи, передбачає вивчення їх по додаткових тестах, що визначають належність до біоварів (гемаглютинація, чутливість до поліміксину, реакція Фогес-Проскауера та ін.).
4.3.7.4. У культур холерних вібріонів, які чутливі до монофагу ельтор, вивчають їх відношення до холерних діагностичних фагів - ХДФ 3,4,5.
4.3.7.6. Визначення вірулентності культур холерних вібріонів 01 комплексним методом проводять у відповідності з настановою до препаратів ХДФ.
4.3.7.8. Культури V.cholerae 01, RO і 0139 серогруп вивчають по гемолітичній активності в пробі Грейга і чутливості до антибіотиків, які використовуються в клінічній практиці для лікування холери.
4.3.7.7. На культури, що мають характерні для вібріонів морфологічні і культуральні ознаки, які відносяться до 1 групи по Хейбергу, що аглютинуються 01, RO і однією з варіантоспецифічних сироваток не менше ніж до 1/2 титру, які лізуються і не лізуються холерними і ельтор фагами, а також на культури, що аглютинуються сироваткою 0139, видають остаточну відповідь. указавши чутливість до антибіотиків і гемолітичну активність.
Таблиця 5
Розподілення патогенних вібріонів по групах Хейберга
Вид вібріонів |
Ферментація |
Група Хейберга |
арабінози |
манози |
сахарози |
V. cholerae 01 |
- |
+(-) |
+ |
I (II) |
V. cholerae non 01 |
- |
+(-) |
+ |
I (II) |
V. mimicus |
- |
+ |
- |
V |
V. metschnikovii |
- |
+- |
+ |
I, II |
V. fluvialis |
+ |
+ |
+ |
ІІІ |
V. vulnificus |
- |
+ |
- |
V |
V. alginolyticus |
- + |
+ |
+ |
І, ІІІ |
V. parahaemolyticus |
+(-) |
+ |
- |
VII (V) |
V. hollisae |
+ |
-(+) |
- |
VIII(VII) |
V. furnisii |
+ |
+(-) |
+ |
III (IV) |
з утворенням газу |
V. damsela |
- |
+ |
- |
V |
з утворенням газу у деяких штамів |
V. anguillarum |
+- |
х |
+ |
X |
V. cincinnatiensis |
+ |
х |
+ |
X |
V. ordallei |
- |
- |
+ |
ІІ |
V. salmonicida |
х |
- |
х |
Х |
V. carcharia |
х |
х |
х |
Х |
Позначення: () в дужках вказані варіанти, які рідко зустрічаються.
Таблиця 6
Основні диференційовані ознаки роду Vibrio і споріднених мікроорганізмів
Ознаки |
Роди родини. Vibrionaceae |
Enterobac-teriaceae |
Pseudo-monas |
Vibrio, в т.ч. |
Aero-monas |
Plesio-monas |
Photobac-terium |
V.cho- lerae |
інші види |
Морфологія, фарбування по Граму |
Грам. |
негативні |
поліморфні |
прямі |
або зігнуті паличкі |
Рухливість |
+ |
+ |
+(-) |
+ |
+ |
+- |
+ |
Оксидаза |
+ |
+(-) |
+ |
+ |
+ |
- |
+(-) |
Ріст на середовищах без NaCl |
+ |
-(+) |
+ |
+ |
- |
- |
- |
Чутливість до 0129 |
+ |
+ |
- |
+(-) |
+ |
- |
- |
О/ф глюкози в середовищі Хью-Лейфсона |
+/+ |
+/+ |
+/+ |
+/+ |
+/+ |
+/+ |
+/- |
Газ із глюкози |
- |
-+ |
+(-) |
- |
+ |
+- |
- |
Лізиндекарбоксилаза |
+ |
+(-) |
-(+) |
+ |
+ |
+- |
-(+) |
Аргініндигідролаза |
- |
-(+) |
+ |
+ |
+ |
-+ |
+- |
Ферментація: маніту арабінози сахарози інозиту |
+ - + - |
+ -(+) +(-) -(+) |
+(-) +(-) + - |
- - - + |
- - -(+) - |
+(-) +(-) +- -+ |
+- -(+) - х |
Утворення: ацетилметилкарбінолу індолу нітратредуктази B-галактозидази желатинази |
+(-) + + + + |
+(-) +(-) +(-) +(-) + (-) |
+(-) +(-) + + + |
- - + + - |
+ - +(-) + + |
-(+) - + - (+) -(+) |
х + +- х +- |
Біолюмінесценція |
-(+) |
-(+) |
- |
- |
+ |
- |
- |
Мол. % G+C в ДНК |
38 |
51 |
57-63 |
51 |
40-44 |
39-59 |
58-70 |
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Умовні позначення: х - немає даних; + позитивний результат в 90 %; - негативний результат в 90 %; + - позитивний і негативний результати зустрічаються з однаковою частотою; +(-) або -(+) в дужках рідко спостережений результат.
Таблиця 7
Диференціація патогенних для людини видів вібріонів роду Vibrio
Ознаки |
Види роду Vibrio |
V.cho-lerae |
V.algino- lyticus |
V.an-guil-larum |
V.cincin-natiensis |
V.dam-sela |
V.flu-vialis |
V.fur-nisii |
V.hol-lisae |
V.met-schni-kovii |
V.mi-micus |
V.or-dal-lei |
V.pa-rahae-moly-ticus |
V.sal-moni-cida |
V.ca-rcha-ria |
V.vu-lni-ficus |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
Морфологія |
|
Грамнегативні |
|
|
прямі |
або зігнуті |
|
палички |
|
|
|
|
|
|
|
Рухливість |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Роїння на агарі |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
d |
- |
- |
- |
Індофеноло- ксидаза |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Утворення газу з: глюкози індолу ацетилметил- карбінолу |
- + +(-) |
- + + |
- + + |
- - + |
- - + |
d - - |
- +(-) - |
+ + - |
- +(-) + |
- + - |
- - - |
- + - |
х - - |
х х + |
- + - |
Ферментація: лактози арабінози сахарози целобіози маніту саліцину |
-(+) - + - +(-) - |
- - + - + - |
- + + + + - |
- + + + - + |
- - - - - - |
- + + - (+) + + |
- + + - (+) + - |
- + - - - - |
- (+) - + - + - |
-(+) d - - + - |
- + - + - + - |
- - - - + - |
х х х х х |
х х х х х |
d - - + - (+) + |
Аргінінди- гідролаза |
- |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- (+) |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Лізиндека- броксилаза |
+ |
+ |
- |
+ |
+ (-) |
- |
- |
- |
+ (-) |
+ |
- |
+ |
х |
+ |
+ |
Орнітинде- карбоксилаза |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
х |
х |
+ |
бета-галак- тозидаза |
+ |
- |
+ |
+ - |
- |
+ |
+ |
- |
d |
d |
- |
- |
- |
х |
+ |
Нітроредук- таза |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ - |
+ |
- |
х |
+ |
Амілаза |
+ |
+ |
+ |
+ |
х |
+ |
d |
х |
+ |
- |
- |
+ |
х |
х |
+ |
Желатиназа |
d |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
d |
- |
+ |
d |
+ |
+ |
- |
х |
+ |
Ріст в 1 % пептонній воді з NaCl -"- 0 % -"- 3 % -"- 6 % -"- 10 % |
+ + d - |
- + + + |
+ + +- - |
- + + - |
- + + - |
- (+) + + - (+) |
- (+) + + - |
- + d - |
- (+) -(+) + - |
+ + - х - |
- + х х |
- + + - |
- + - - |
х х + х |
- + d - |
Ріст при: 4 о C 20 о C 35 о C 42 о C 45 о C |
- + + + - |
- + + + - |
- + + - - |
- - + - - |
- - + - - |
- + + d d |
- + + - - |
х х х х х |
- + + d d |
- х + d х |
- + - - - |
- + + d - |
+/- + - - - |
х х х х х |
- + + d - |
Біолюмініс- ценція |
- |
- (+) |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
х |
- |
- |
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Позначення: див. позначення до табл. 6.
Токсигенні штами холерних вібріонів 01 і 0139 серогруп, як правило, не лізують еритроцити барана.
Для холерних вібріонів 01 серогрупи, крім того, вказують біовар на основі чутливості до одного з діагностичних фагів (ельтор або класичного) і/або по допоміжних ознаках для фагорезистентних культур.
4.3.7.8. Для повної характеристики культур холерних вібріонів 01 в спеціалізованих лабораторіях, які забезпечені необхідними індикаторними штамами холерних вібріонів і набором типуючих холерних фагів, визначають фаговар.
4.3.7.9. Вивчення культур холерних вібріонів 01 і 0139 серогруп на токсигенність методом молекулярного зондування або в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) на наявність гену холерного токсину (vct-гену) і на експериментальних тваринах проводять в спеціалізованих лабораторіях.
4.3.7.10. Культури, які мають ознаки вібріонів по морфології колоній і клітин, тесту на індофенолоксидазу і ферментативній активності на полівуглеводному середовищі, які не аглютинуються на склі холерними сироватками 01, RO і 0139 серогруп, виділених від хворих гострими кишковими інфекціями, диференціюють по тестах, які визначають належність до роду Vibrio і виду V. cholerae. Культури, які належать до V. cholerae вивчають в пробі з діагностичними фагами. При виділенні чутливих до холерних діагностичних монофагів, які не аглютинуються холерними сироватками 01, особливе значення має вивчення їх клітинного складу, тому що в популяції таких штамів можуть знаходитись типові холерні вібріони 01 групи.
Якщо культура по сукупності ознак належить до виду холерних вібріонів, її вивчають в реакції аглютинації з набором вібріонних діагностичних сироваток 02-083, що випускає інститут "Мікроб" (Росія).
На культури, що аглютинуються однією з вібріонних сироваток, видають відповідь про виділення V. cholerae 02 . . 05 або іншої серогрупи. Якщо культури не типуються відомими вібріонними сироватками або вони відсутні в лабораторії, то виділену культуру позначають узагальнено - V. cholerae non 01 (так звані НАГ- вібріони).
Штами V. cholerae non 01, крім того, типують набором фагів ТЕПВ і визначають їх чутливість до антибіотиків.
Таблиця 8
Диференційні ознаки біоварів V. cholerae 01
Ознака |
Біовари V. cholerae 01 |
eltor |
cholerae |
Лізабельність монофагами: класичним ельтор |
- + |
+ - |
чутливість до 30 од/мл поліміксину B |
- (+) |
+ |
Аглютинація курячих еритроцитів |
+ (-) |
- |
Утворення ацетилметилкарбіонолу |
+/- |
- |
4.3.7.11. При виділенні із навколишнього середовища вібріонів, що не аглютинуються холерними 01, RO і 0139 сироватками, доцільність повної таксономічної характеристики визначається індивідуально для конкретних територій і об'єктів з врахуванням частоти аналогічних варіантів і епідситуації по холері.
4.3.8. Ідентифікація атипових культур холерних вібріонів.
4.3.8.1. До атипових відносять культури холерних вібріонів, що відхиляються по окремих ознаках, які визначають належність до відповідної таксономічної категорії. Це різні антигенні варіанти (з ослабленою або втраченою аглютинабельністю сироватками 01, Інаба, Огава), і R-варіанти, що аглютинуються відповідними сироватками при наявності зниження або відсутності аглютинабельності сироватками 01 серогрупи. В останні роки і серед епідемічних і неепідемічних штамів помітно зросла частота кількості холерних вібріонів, резистентних до холерних діагностичних фагів. В той же час зустрічаються штами, що слабо аглютинуються сироваткою 01 проти зберігшими чутливість до холерних діагностичних фагів. Антигенна варіабельність нерідко поєднана з мінливістю по тим або іншим культурально-морфологічним, біохімічним ознакам і чутливістю до фагів.
Деякі труднощі для ідентифікації мають штами холерних вібріонів, що змінені по культурально-морфологічним ознакам, які утворюють шорсткуваті, мутні, пігментовані карликові колонії. В мазках, що зроблені з таких культур, виявляються подовжені, спіралевидні, кульовидні клітини. Нерідко зустрічаються штами, які змінені по біохімічним властивостям, у яких відмічається послаблення або втрата можливості розкладати вуглеводи і багатоатомні спирти (мапіт, манозу, сахарозу, крохмаль), амінокислоти (лізин, орнітин, трипто.фан) та ін. субстрати.
4.3.8.2. У всіх випадках ізоляції атипових культур обов'язкове вивчення їх по ряду додаткових ознак, що визначають їх належність до роду Vibrio і виду холерних вібріонів (визначення декарбоксилаз лізину, орнітину, дигідролази аргініну, оксидазної активності, типу розщеплення глюкози на середовищі Хью-Лейфсона та ін.).
4.3.8.3. Культури холерних вібріонів, що мають вказані вище ознаки роду Vibrio і виду cholerae і які аглютинуються сироватками 01 до 1/4 титру, лізуються діагностичними монофагами в діагностичному титрі, належить підносити до серовару 01.
4.3.8.4. Вищезазначені та інші атипові варіанти культур холерних вібріонів необхідно направляти для подальшого вивчення в спеціалізовані лабораторії.
4.3.8.5. Для підтвердження належності до V. cholerae 01 культур, які слабо аглютинуються, дисоциюють та фагорезистенті, необхідно обов'язково використовувати високочутливі серологічні методи (імунофлюоресцентний, специфічної імобілізації вібріонів, РНГА, імунопреципітації в гелі, ПЛР з специфічними праймерами та ін.).
При вивченні культур, атипових за тестами серологічної ідентифікації рекомендуються, крім того, використовувати реакції перехресної адсорбції аглютининів по Кастеляні, реакції аглютинації з культурами убитими кип'ятінням, імунофлюоресценції з відповідними імуноглобуліновими препаратами та пробу з комплементами.
4.3.8.6. Для культур холерних вібріонів, що аглютинуються тільки RO сироваткою, обов'язково додаткове підтвердження специфічності їх взаємодії в реакції імобілізації вібріонів або преципітації в гелі.
4.3.8.7. Для серологічної ідентифікації культур, що аглютинуються спонтанно, застосовуються РНГА, імунопреципітацію або реакцію глютинації з використанням осадженої культури і 0,3 % розчину хлористого натрію для розведення діагностичних сироваток і приготування суспензії вивчаємої культури.
4.3.9. Прискорена ідентифікація культур.
Окрему колонію або чисту культуру висівають в 3 мл поживного бульону і після 3 годин інкубації вивчають за тестами:
- аглютинабельності О-холерними діагностичними сироватками в 1 % пептонній воді;
- чутливості до холерних діагностичних бактеріофагів;
- належності до біохімічної групи (по Хейбергу); при використанні відповідних диференціальних середовищ Гісса в об'ємі 1 мл через 3-6 годин інкубації при (37+/-0,5 град. C) проводять облік результатів.
4.4. Порядок проведення обліку аналізів, оформлення і видача результатів.
4.4.1. Відповідь про позитивний результат може бути попередньою та остаточною.
4.4.2. Попередню позитивну відповідь видають по результатах прискореного дослідження нативного матеріалу і після підрощування його в пептонній воді за допомогою імунофлюоресцентного методу, специфічної імобілізації, РНГА, а також по слайд-аглютинації сироватками 01 і 0139 підозрілих на холерний вібріон колоній.
4.4.3. Остаточну позитивну відповідь видають по результатах повної, скороченої або прискореної ідентифікації виділеної культури через 18-72 годин (при цілодобовій роботі лабораторії).
4.4.4. Негативна відповідь може бути видана тільки по закінченню досліджень по повній схемі через 36-48 годин. В умовах однозмінної роботи лабораторії, при використанні консервантів, тривалість аналізу збільшується до 3-5 діб. Забороняється давати відповіді при негативних результатах прискореного дослідження (імунолюмінсцентного, РНГА та ін.) до закінчення аналізу.
4.4.5. При здійсненні епідемічного нагляду направлення на аналіз, а відповідно і відповідь на нього оформлюють індивідуально на кожного хворого. При обстеженні здорових людей на вібріононосійство і дослідженні на холеру об'єктів навколишнього середовища групові форми направлення і відповідей допускаються як при епіднагляді, так і у вогнищі холери.
4.4.6. При проведенні великого об'єму досліджень на холеру хворих гострими кишковими захворюваннями у вогнищі направлення на аналізи і відповіді на них оформлюють списком.
4.4.7. Облік аналізів і культур проводять за встановленими формами (додатки 9-12). Обов'язковим є ведення робочих записів дослідження підозрілих культур. При роботі у вогнищі холери використовують спрощені форми реєстрації аналізів, враховуючи, що більш докладні свідчення є в бланках направлень, що знаходяться в лабораторії до ліквідації вогнища. Для зручності роботи направлення за кожний день підшивають окремо.
4.5. Методи прискореної діагностики.
При дослідженні матеріалу від хворих з підозрою на холеру, від осіб, які померли від гострих кишкових захворювань, нарівні з класичними методами використовуються прискорені методи діагностики.
4.5.1. Люмінісцентно-серологічний метод.
Метод дає можливість виявити збудника холери в S-формі при наявності його в досліджуваному матеріалі не менш ніж 10^5 м.кл. в 1 мл (дослідженню підлягає нативний матеріал - випорожнення і блювотні маси, а також матеріал після підрощування).
Порядок приготування мазків, їх люмінісцентне офарблення, мікроскопія та оцінка результатів є загальними для всіх бактерій, які описані в "Наставленні по використанню сироватки діагностичної холерної люмінісцентної".
Позитивний результат може бути отримано через 1,5-2 години від початку дослідження.
Для знищення неспецифічного свічення слід використовувати як "гасник" бичий альбумін, що мічений родаміном. Методика його застосування описана в "Наставленні по використанню сухого альбуміну, міченого родаміном".
4.5.2. Метод імобілізації вібріонів під впливом специфічної холерної 01 сироватки.
Метод дає можливість знайти збудника напротязі декількох хвилин при концентрації його в досліджуваному матеріалі не менше ніж 10^5 м.кл. в 1 мл. На предметне скло піпеткою або петлею наносять 2 краплини випорожнень, блювотних мас або верхнього шару I чи II пептонної води.
Першу краплю накривають покровним склом (контроль), до другої додають краплю холерної 01 сироватки в розведенні 1:100, перемішують і також накривають покровним склом. Роздавлену краплю дивляться під мікроскопом при збільшенні 400-600х, використовуючи фазово-контрасний пристрій чи конденсор темного поля.
При наявності в досліджуваному зразку холерних вібріонів в першій краплі спостерігають характерний рух, в другій спостерігається імобілізація окремих мікробних клітин і утворення мікроаглютинатів негайно або протягом 1-2 хвилин. У разі неспецифічної взаємодії з діагностичними сироватками спостерігається утворення дрібних рухомих конгломератів при активній рухомості окремих клітин.
Реакція імобілізації специфічна і дозволяє дати першу сигнальну відповідь через 15-20 хвилин від початку дослідження.
При негативному результаті дослідження повторюють після підрощування в 1 % пептонній воді.
4.5.3. Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з використанням холерного імуноглобулінового еритроцитарного діагностикуму.
Порядок підготовки матеріалу, інгредієнтів постановки реакції та її облік викладені в "Настановленні по застосуванню діагности куму холерного еритроцитарного антитільного", що додається до препарату.
4.6. Методи вивчення властивостей холерних вібріонів.
Можуть вживатися як макро, так і мікротести.
4.6.1. Серологічні властивості вивчають в слайд-аглютинації або розгорнутій реакції аглютинації з холерними сироватками 01, Інаба, Огава і RO, а також з сироваткою 0139 серогрупи.
4.6.1.1. Слайд-аглютинацію ставлять на знежиреному склі, в чашці Петрі, використовуючи підозрілу на холерний вібріон колонію і/або агарову 12-18 годинну культуру і сироватки 01 серогрупи в розведенні 1:50 - 1:100. Сироватку 0139 розводять відповідно даних на етикетці. Реакцію обов'язково супроводжують контролями культури в фізіологічному розчині.
4.6.1.2. Розгорнуту реакцію аглютинації ставлять і враховують за загальноприйнятою методикою відповідно з наставленням до діагностичної сироватки.
4.6.1.3. Розгорнута реакція аглютинації в 0,3 % NaCl з осадженою культурою.
Діагностичні сироватки двократно розводять 0,3 % розтином натрію хлориду в об'ємі 0,5 мл відповідно величині діагностичного титру. Суспензію вивчаємої культури готують в тому ж розчині з концентрацією більше 1 млрд/мл в об'ємі 8-10 мл, витримують при кімнатній температурі на протязі 1-1,5 годин. В реакції використовують поверхневий шар мікробної суспензії, розведеної 0,3 % розчином натрію хлориду до концентрації 1 млрд/мл, додають її по 0,5 мл у всі розведення сироватки і контроль культури (0,5 мл 0,3 % розчину натрію хлориду + 0,5 мл мікробної суспензії).
Облік і оцінка результатів аналогічні основному варіанту розгорнутої реакції. Використання 0,3 % розчину натрію хлориду дає можливість виключити спонтанну аглютинацію.
4.6.1.4. До методів експресної серологічної ідентифікації належать: мікроаглютинація та імобілізація за допомогою холерних вібріонів, люмінісцентно-серологічний, РНГА та ін.
4.6.2. Біохімічні властивості.
4.6.2.1. Визначення індофенолоксидази. Реактиви :
- двокомпонентний: - 1 % водний розчин пара-амінодиметиланіліну (гідрохлориду чи оксалату) і 1 % спиртовий розчин альфа-нафтолу;
- однокомпонентні: - 1 % водні розчини диметил-пара-фенілендіаміну, тетраметил-пара-фенілендіаміну (гідрохлориду) чи етилокси-парафенілендіаміну сірчанокислого (з набору для обробки паперу "фотоколір").
Реактиви повинні бути безколірними, їх необхідно зберігати у флаконі з темно-коричневого скла із скляною пробкою без доступу світла, в холодильнику. В разі зберігання реактиву у флаконі світлого кольору їх належить обгорнути алюмінієвою фольгою або темним папером.
Постановка проби:
а) на поверхню 18-годинної агарової культури, підозрілої колонії або напівзливного росту на чашку наносять 1 краплю 1 % спиртового розчину параамінодиметиланіліну (гідрохлориду чи оксалату) і 1 краплю 1 % водного розчину альфа-нафтолу.
Позитивна реакція на індофенолоксидазу - яскраво синє забарвлення культури через 1-2 хвилини
При використанні однокомпонентних реактивів цим же методом в позитивних випадках - червоне забарвлення культури.
б) для постановки проби на оксидазу можна використовувати спеціальні реактивні папірці З набору СІП або смужки фільтрувального паперу, змоченого 2-3 краплями 1 % водного розчину диметил-пара-фенілендіаміну. Культуру наносять на смужку паперу, змочену реактивом платиновою петлею (але не хромонікелевою), скляною або дерев'яною паличкою і розмазують у вигляді невеликої плями. Через 10-30 секунд з'являється пурпурово-червоне або синє (в залежності від реактиву) забарвлення, що свідчить про позитивну реакцію. Із грамнегативних бактерій позитивну пробу на індофенолоксидазу дають Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Plesiomonas, а негативну - всі Enterobacteriaceae.
Враховуючи можливу нестійкість реактивів і різну здатність вібріонів утворювати оксидазу на різних поживних середовищах, пробу обов'язково супроводжують позитивними та негативними контролями відповідно з культурами Vibrio або Pseudomonas і Enterobacteriaceae, які вирощені на поживному агарі, що використовується в лабораторії.
4.6.2.2. При відсутності реактивів на оксидазу можна використовувати пробу "тяжа". На чашку Петрі наносять краплю 0,5 % водного розчину дезоксихолату натрію або 2,5 % розчину миючого засобу "Прогрес" і суспензують 18-годинну агарову культуру досліджуваного штаму. При позитивній реакції суспензія негайно втрачає мутність, стає слизистою і в'язкою - тягнеться за петлею, що характерно для вібріонів.
Проба дозволяв диференціювати вібріони не тільки від enterobacteriaceae, але і від інших родинних грам негативних мікроорганізмів, які не утворюють, "тяжа". Виключення складають лише деякі штами Aeromonas, які на протязі приблизно 60 секунд утворюють нитку, яка слабо тягнеться.
4.6.2.3. Визначення типу розкладання глюкози (тест Хью-Лейфсона). В дві пробірки з середовищем Хью-Лейфсона засівають уколом в стовпчик культуру, що вивчають. Поверхню середовища в одній з пробірок заливають 0,5-1 мл стерильного вазелінового масла. Посіви інкубують при температурі (37,0+/-0,5о C) 1-4 дні. Окислення визначають по жовтому забарвленню середовища тільки в аеробних, ферментацію - в аеробних та анаеробних умовах росту.
Вібріони розкладають глюкозу по ферментативному типу.
4.6.2.4. Визначення декарбоксилазної активності проводять на спеціальних середовищах. В пробірки з середовищами - лізином, орнітином, аргініном засівають по повній петлі 18-годинної культури і заливають 0,5-1 мл стерильного вазелінового масла, включаючи контролі середовищ. Інкубують посіви при (37,0+/-0,5о C). Облік результатів проводять щоденно, при негативному результаті спостерігають - 1-4 доби. В результаті ферментації глюкози спочатку відбувається зрушення pH в кислу сторону, а в подальшому при декарбоксилуванні амінокислот нагромаджуються аміни і відбувається залуження середовища.
4.6.2.5. Ферментацію вуглеводів і багатоатомних спиртів (глюкози, лактози, манози, сахарози, арабінози, маніту, саліцину, дульциту, інозиту, крохмалю та інш.) визначають в рідких або напіврідких середовищах Гісса з індикатором бромтимоловим синім, Андреде, ВР. Культуру, що вивчають, вирощують на протязі 12-20 годин на твердому, або 3-4 години на рідкому поживному середовищі.
Посіви на середовищах з вуглеводами і спиртами інкубують при 37о C і ведуть облік через 6-18 годин.
4.6.2.6. Визначення діастатичної активності. Культуру засівають в середовище з крохмальом і індикатором Андреде, інкубують 12-18 годин при 37о C. При розщепленні крохмалю середовище червоніє.
4.6.2.7. Визначення протеолітичних властивостей. В стовпчик желатини уколом засівають 18-годинну культуру і інкубують на протязі 2-3 діб при температурі (22+/-0,5о C) або (37+/-0,5о C) на протязі 18 годин. Перед обліком результатів пробірки ставлять в холодильник на 20 хвилин. При позитивному результаті желатина залишається рідкою, а при негативному (і в контрольній пробірці) - затвердіває.
4.6.2.8. Визначення утворювання індолу. Холерні вібріони володіють ферментом триптофаназою і при вирощуванні в середовищах, які містять триптофан (пептонна вода, м'ясо-пептонний бульйон, бульйон Хоттингера та інші), розщіплюють його з утворенням індолу, що виявляється за допомогою індикаторних папірців (розділ 6.3.4.) або реактиву Ерліха.
4.6.2.9. Визначення утворення сірководню. Холерні вібріони не утворюють ферменту тіосульфатредуктази, так як не здатні розщіплювати неорганічні сіркоутримуючі сполучення, які є в середовищі Кліглера - це є диференційною ознакою. Однак вони, також як деякі інші ентеробактерії, виробляють фермент цистиндесульфогідролазу, за рахунок якого здатні утворювати сірководень із сіркоутримуючих амінокислот, що є в достатній кількості в бульйоні Хоттингера, Мартена та деяких інших середовищах.
4.6.2.10. Визначення здатності фосфоресцирувати. Штами, які вивчають, засівають в 1 % пептонну воду або на пластинки лужного агару, інкубують при температурі (37+/-0,5о C) на протязі 12 годин. Культури, які виросли, переглядають в темній кімнаті. Світіння спостерігають після 5-10 хвилинної адаптації в темноті.
4.6.2.11. Для визначення оксидази, уреази, індолутворення, декарбоксилаз лізину, орнітину, дигідролази аргініну, ферментації вуглеводів і багатоатомних спиртів при ідентифікації вібріонів також можна використовувати Систему індикаторну паперову (СІП) або інші мікротестсистеми.
4.6.3. Визначення чутливості до діагностичних фагів. В лабораторній діагностиці холери використовують бактеріофаги С і ельтор. При оцінці результатів проб з фагами необхідно орієнтуватися на діагностичний робочий титр (ДРТ), який звичайно позначають на етикетках. Визначення чутливості до фагів проводять цільними препаратами, а також з їх 10-кратними розведеннями до ДРТ в м'ясо-пептонному бульйоні.
4.6.3.1. Для постановки реакції в чашки розливають лучний агар. Після, застигання агару і підсушування його на протязі 30 хвилин при 37 о C дно чашок розподіляють на квадрати по кількості зразків фагів та їх 10-кратних розведень. В пробірку з 5 мл 0,5-0,7 % лужного агару, розплавленого і охолодженого до 45о C, додають 0,1-0,2 мл 3-4 годинної бульйонної культури, ретельно перемішують і виливають на поверхню агару. Чашки залишають при кімнатній температурі з напіввідкритими кришками на 30 хвилин. В центр квадратів наносять штампом-реплікатором, стандартною петлею або тонко відтянутою пастерівською піпеткою по краплі фагів в відповідних розведеннях. Після підсихання крапель чашка перевертають догори дном і ставлять в термостат при температурі (37+/-0,5 о C). Результати враховують через 2-4 і 18-20 годин. Наявність лізису у вигляді однієї "стерильної" плями або групи дрібних негативних колоній оцінюється як позитивний результат.
4.6.4. Допоміжні тести диференціації біоварів V.cholerae 01 серогрупи.
4.6.4.1. Визначення чутливості до поліміксину. В розплавлений і охолоджений до 45-50 о C поживний агар (pH 7,1+/-0,1)
додають поліміксин М або В з розрахунку 30 одиниць на 1 мл середовища. Після ретельного змішування середовище розливають в чашки Петрі. На застиглі агарові пластинки наносять звичайною бактеріологічною петлею 18-ти або 3-годинну бульйонну культуру.
Результати враховують після інкубації посівів при (37+/-0,5 о C) на протязі 18 годин. Холерні вібріони біовару cholerae не ростуть на поліміксиновому агарі, біовару eltor- по-різному.
4.6.4.2. Постановка реакції гемаглютинації. На предметне скло в чашку Петрі наносять краплю фізіологічного розчину і суспендують в ній петлею 18-годинну агарову культуру. Потім додають краплю 2,5 % суспензії курячих еритроцитів, тричі відмитих фізіологічним розчином. Скло коливають до змішування суспензії еритроцитів та вібріонів. При позитивній реакції на протязі 1 хвилини наступає склеювання еритроцитів. Реакцію супроводжують двома контролями: а) в краплю фізіологічного розчину додають краплю 2,5 % суспензії еритроцитів;
б) в краплі фізіологічного розчину суспендують культуру, яку досліджують. Контролі повинні бути негативними.
4.6.4.3. Постановка реакції Фогес-Проскауера (на ацетилметилкарбінол). Досліджувану культуру сіють в глюкозо-фосфатний бульйон Кларка і інкубують при (37+/-0,5 о C) на протязі 1-3 діб. Потім до 1 мл культури додають 0,6 мл 6 % спиртового розчину альфа-нафтолу і 0,4 мл 40 % розчину їдкого калію. Пробірки зтрушують і ставлять в термостат на 1 годину. При позитивній реакції середовище забарвлюється в рожевий або яскраво-червоний колір.
4.6.5. Оцінка вірулентності холерних вібріонів.
4.6.5.1. Визначення вірулентності холерних вібріонів ельтор по фаговому тесту і гемолітичній активності проводиться відповідно з наставленням, яке прикладається до препаратів діагностичних ХДФ-фагів.
Для постановки проби з фагом використовують 1,5-2,0 % лужний агар pH 7,4+/-0,2, виготовлений на будь-якій основі. Агар розливають в чашки Петрі і підсушують при кімнатній температурі. В пробірку з 4 мл 0,7 % лужного агару, розплавленого на водяній бані і охолодженого до 45 о C, додають 0,2-0,3 мл 3- 4 годинної бульйонної культури досліджуваного штаму, ретельно імітують і виливають на поверхню агарових пластин Після застигання напіврідкого агару чашки знову підсушують з напіввідкритою кришкою при кімнатній температурі, готують 10-кратне розведення фагів ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5 до ДРТ, вказаного для кожного з них. Петлею або штампом-реплікатором наносять фаги з усіх розведень на поверхню напіврідкого агару. Після підсихання крапель фагів на поверхні агару, чашки закривають, перевертають догори дном і інкубують при температурі (37+/-0,5 о C) 16-18 годин, в термінових випадках результати враховуються через 3-4 години.
Оцінку результатів проводять по чотирибальній системі: 4 – повний лізис; 3 - численні негативні плями, 2 - пляма лізису із значним вторинним ростом або ізольовані негативні колонії. Позитивним вважають лізис культури на 4 та 3 "+" фагом в ДРТ.
4.6.5.2. Визначення гемолітичної активності ( по Грейгу).
До 1 мл добової культури, вирощеної в 4-5 мл м'ясо-пептонного бульйону або серцево-мозкового інфузу, додають 1 мл 1 % суспензії тричі відмитих еритроцитів барана в фізіологічному розчині. Суміш мікробів та еритроцитів змішують і ставлять на 2 години в термостат при температурі (37+/-0,5 о C), а потім в холодильник до наступного дня. Попередній результат враховують через 2 години, остаточний - наступного дня. При позитивній реакції настає повний або частковий лізис еритроцитів (лакова кров). В контролі (бульйон 1 мл + 1 мл суспензії еритроцитів) гемоліз відсутній. Вірулентність культури визначають по сукупності ознаків, вказаних в наставленні до препаратів фагів ХДФ.
4.6.5.3. Визначення вірулентності холерних вібріонів на моделі кроликів сисунців.
Дослідження можуть проводити лабораторії, які мають дозвіл на експериментальну роботу із збудниками I-II груп патогенності.
Внутрішньокишково заражені кролики сисунці є найбільш чутливою моделлю експериментальної холери.
Для зараження тварин використовують 4-годинну агарову культуру, вирощену при температурі (37+/-0,5 о C), або 18-годинну - при температурі 20+2 о C Необхідно використовувати дві заражаючі дози 1.10^5 та 1.10^7 м.кл., які вводять внутрішньокишково в об'ємі 0,2 мл двом кроликам. Кроликів, яким 10-12 днів, вагою 130-160 г, фіксують до станка черевом догори, вистригають шерсть на операційному полі і змазують шкіру йодом. Дають ефірний або тіопенталовий наркоз (0,2 мл 1 % розчину на 100 г ваги в/м), накривають стерильною серветкою з розрізом посередині. Після засипання тварин роблять розріз довжиною 1 см по середній лінії живота до рівня пупка. Через невеликий розріз черевної стінки витягують петлю тонкого кишечника на довгій оточині, фіксують за допомогою м'якого пінцету і вводять суспензію вібріонів. Петлю занурюють в черевну порожнину, черевну стінку і шкіру пошарово зашивають. Шов змазують йодом. Кроленят, яких оперували, годують за допомогою шприців молоком і спостерігають 48 годин. Всіх загиблих і забитих через 48 годин тварин розтинають.
Найбільш виражені зміни спостерігаються в товстому кишечнику, що розтягнений безколірною або світло-жовтою прозорою чи трохи опалесцируючою рідиною. Сліпа кишка і прилеглі відділи товстого кишечника можуть бути настільки розтягнуті, що через них видно підлежачі петлі кишечника, що створює видимість повної прозорості вмісту кишечника. Тонкий кишечник розширений і також має напівпрозорий вміст. Можлива ін'єкція судин оточини. Описані зміни характерні для "синдрому холерогенності" , що спостерігаються при зараженні епідемічно небезпечними штамами, які мають ген холерного токсину.
Вірулентні штами викликають смерть більшості заражених тварин дозами 10^5-10^7 м.кл. на протязі перших двох діб з типовим "синдромом холерогенності".
Слабовірулентні вібріони викликають смерть поодиноких тварин, заражених дозами 10^5-10^7 м.кл. Вміст кишечника мутний, іноді жовтого, коричневого або зеленкуватого кольору.
Авірулентні штами не викликають захворювання, смерть кроленят і макроскопічних змін в кишечнику. Вірулентні штами виділяються переважно від хворих і носіїв холери, а також з об'єктів навколишнього середовища у вогнищах холери.
Слабо- і авірулентні штами ізолюють головним чином з об'єктів навколишнього середовища і інколи від людей при поодиноких випадках захворювань або вібріононосійства.
Обов'язковій перевірці вірулентності на моделі кроликів-сосунків, підлягають такі штами V. cholerae 01 серогрупи:
а) Виділені від людей:
- гемолізпозитивні штами холерних вібріонів;
- гемолізнегатівні штами холерних вібріонів, атипові по серологічних ознаках і по відношенню до бактеріофагів.
б) Виділені з об'єктів навколишнього середовища:
- гемолізнегативні, вірулентні по фаговому тесту штами холерних вібріонів, виділені при відсутності епідускладнень по холері;
- гемолізнегативні, типові по серологічним властивостям, чутливі до діагностичного фагу ельтор, але слабовірулентні по комплексному методу.
Обов'язковій перевірці вірулентності на моделі кроликів-сосунків підлягають також всі штами холерних вібріонів 0130 серогрупи, виділені від людей та із об'єктів навколишнього середовища.
4.6.5.4. Оцінка холерних вібріонів на наявність гену холерного токсину з метою визначення епідвагомості виділених штамів проводиться методом молекулярного зондування за допомогою ДНК-зонду.
Для одержання відбитків 3-6 годинну культуру холерних вібріонів, що виросла при температурі (37+/-0,5 о C), наносять бактеріологічною петлею або штампом-реплікатором на поверхню лужного агару і ставлять в термостат при температурі (37+/-0,5 о C) на 18-24 години для отримання колоній 2-3 мм в діаметрі. Нітроцелюльозний фільтр (Hybond C або Schlericher a. SchuelGermany) накладають на поверхню агару з колоніями, через 1 хв. (після промокання фільтру) знімають і кладуть відбитками колоній догори на фільтрувальний папір, змочений 0,5 N NaOH, через 5 хв. перекладають на новий папір, змочений тим же розчином, і витримують ще 5 хв. При цьому відбувається лізис клітин (на вигляд - колонії приймають вид крапель слизу) та денатурація ДНК.
Фільтр переносять на фільтрувальний папір, змочений нейтралізуючим буфером 1. Процедуру повторюють 3-4 рази з інтервалом до 5 хв., кожного разу використовують свіжий папір, змочений тим же буфером. Фільтр підсушують на повітрі, на сухому аркуші фільтрувального паперу, на протязі 5-10 хв. і промивають 2-3 рази по 10 хв. при кімнатній температурі в 20-30 мл нейтралізуючого буферу 2. Фільтр спершу кладуть колоніями догори на поверхню розчину і через 1-2 хв. занурюють в нього.
Фільтр висушують на повітрі і прогрівають при температурі 80+/-0,5 о C на протязі 1,5-2 години для фіксації денатурованої ДНК. Оброблений таким чином фільтр кладуть між двома аркушами фільтрувального паперу в поліетиленовий пакет, герметично запаюють і пересилають в щільній упаковці (бажано картонній) в заклади, які проводять ці дослідження.
Приготування буферних розчинів
Нейтралізуючий буфер 1 (0,2 M трис-HCl, pH 7,5+/-0,1 + 1M NaCl):
1M трис-HCl - 20 мл
5M NaCl - 20 мл
H2O - до 100 мл
Для приготування початкового 1M трис-HCl буферу pH 7,5+/-0,1 вагу сухої трис-основи (121,1 г) розчиняють в 600 мл дистильованої води, доводять pH до 7,5+/-0,1 соляною кислотою, потім доводять загальний об'єм розчину до 1 л.
5M NaCl - 292,5 г NaCl + H2O до 1 л.
Нейтралізуючий буфер 2 (2^x SSC + 50 mM ЕДТА + 25 mM калій фосфатного буферу pH 7,0)
20^xSSC - 50 мл
0,5M ЕДТА - 50 мл
1M К-фосф. буфер pH 7,0 - 12,5 мл
H2O - до 500 мл
20^xSSC
NaCl - 175,5 г
Цитрату натрію - 88,3 г
H2O - до 1 л
Для приготування 1M калій-фосфатного буферу pH 7,0 змішують 61 мл 1M K2HPO4 (34,8 г/200 мл води) з 39 мл KH2PO4 (27,2 г/200 мл води) і перевіряють pH за допомогою pH-метра, доводять до 7,0 добавкою одного або другого розчину.
0,5M ЕДТА
До 93 г ЕДТА-Na2 додають 300-350 мл підігрітої дистильованої води і поступово доливають концентрований розчин NaOH до повного розчинення і далі до pH 7,5+/-0,1. Загальний об'єм доводять водою до 500 мл.
4.6.5.5. Ген холерного токсину може бути виявлений в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) із специфічними праймерами.
Для визначення можуть бути використані культури холерних вібріонів або їх відбитки на нітроцелюльозних фільтрах.
4.6.6. Фаготипування холерних вібріонів.
Визначення фаготипу циркулюючих штамів холерних вібріонів в умовах епідемічного спалаху допомагає виявляти джерело інфекції і шляхи її розповсюдження всередині відносно ізольованого вогнища та встановлювати епідемічний зв'язок між окремими вогнищами.
Дослідження та облік результатів проводять у відповідності до інструкції по використанню препаратів.
4.6.7. Визначення чутливості холерних вібріонів до антибіотиків та хіміопрепаратів.
Чутливість холерних вібріонів до антибіотиків та хіміопрепаратів визначають кількісним методом серійних розведень в поживному середовищі або методом дифузії в агар з використанням дисків і системи напівкількісного обліку результатів.
4.6.7.1. Метод дифузії з використаним агар дисків.
Ступінь чутливості мікроорганізмів до антибіотиків визначається методом дифузії в агар і залежить від дотримання умов та стандартності препаратів, які використовуються. При постановці методу використовують "сухий поживний агар для визначення чутливості до антибіотиків" (АПВ) та диски виробничого виготування. Середовище з сухого поживного агару (АПВ), виготовленого згідно з прописом, вказаним на етикетці, розливають тонким шаром в чашки Петрі і підсушують. З тієї ж основи (АПВ) готують напіврідкий (0,7 %) агар і розливають по 3 мл в пробірки. Суспензію штаму, що досліджують в концентрації 10^8 м.кл./мл або 3-4 - годинну бульйонну культуру в кількості 0,3 мл вносять в 3 мл розтопленого і охолодженого до 45о C напіврідкого агару, перемішують і виливають на поверхню основного шару поживного агару в чашці Петрі. При відкритті чашки з нанесеним напіврідким агаром, який вміщує досліджувану культуру підсушують при кімнатній температурі 10-15 хв. Потім на поверхню засіяного середовища кладуть диски з антибіотиками (не більше 6) і догори дном ставлять в термостат при температурі (37+/-0,5 о C) на 10-20 годин. Зони затримки росту культури навкруги дисків міряють по найбільш чіткому контуру за допомогою лінійки з точністю до 1 мм. При наявності великих колоній по периферії зони границі її визначають по внутрішньому краю цієї групи колоній. Наявність колоній по всій зоні затримки росту при виключенні забруднення сторонньою мікрофлорою свідчить про гетерогенність популяції досліджуваного штаму.
Оцінка результатів проводиться по таблиці 7 з віднесенням штамів до чутливих або стійких по відношенню до антибактеріального препарату. В таблиці також вказані значення мінімальних пригнічуючих концентрацій (МПК), корегуючих з діаметром зон затримки росту навколо диску з антибіотиком. У випадку необхідності МПК антибіотика обчислюють по рівнянню регресії, підставивши до нього значення величини зони затримки росту.
4.6.7.2. Метод серійних розведень в агарі.
Для визначення використовують сухий поживний агар (АПВ), сухий лужний агар на основі ферментативного пептону з дріжджовим екстрактом, сухий лужний дріжджовий агар. Наважку антибактеріального препарату або вміст флакону розчиняють в дистильованій воді і в разі необхідності додатково розводять з таким розрахунком, щоб основний розчин містив 2000 од. або мкг в 1 мл. Для розчинення деяких препаратів застосовують спеціальні розчини: для ріфампіцину, доксицикліну і нітрофуранів - диметилформамід, левоміцетин та еритроміцин попередньо розчиняють в мінімальній кількості етилового спирту, додаючи до необхідного об'єму дистильовану воду. У випадку використання таблеток їх розтирають та розчиняють повністю, або в цілях економії препарату, зважують, ділять величину ваги на активність і отримують поправочний коефіцієнт для визначення розміру ваги препарату, необхідної для розчину заданої активності. Наприклад, таблетка еритроміцину з активністю 100000 од. важить 160 мг (160000 мкг). При діленні ваги одержуємо величини поправочного коефіцієнту 1,6, який означає, що для одержання концентрації 2000 од./мл в об'ємі 10 мл потрібно взяти важку 32 мг (2000 мкг/мл х 10 мл х 1,6 = 32000 мкг = 32 мг). Основний розчин антибіотику титрують двократно в фізіологічному розчині окремими піпетками для отримання ряду концентрацій, які в 10 раз перевищують ті, які необхідно отримати в 1 мл агарового середовища. Потім, 1,5 мл кожного розведення антибіотику виливають в стерильну чашку Петрі, додають 13,5 мл розплавленого агару, ретельно перемішують, дають агару застигнути і підсушують. Для посіву використовують 3-4 - годинну агарову культуру або суспензію агарових культур в концентрації 10^8 м.кл./мл. Посів проводять петлею на сектори або штампом-реплікатором. На одну чашку можна нанести до 20-25 культур, чашки інкубують при температурі (37+/-0,5 о C) - 16-20 годин. МПК визначають по найменшій концентрації, яка пригнічує ріст культури на поверхні агарового середовища. По розміру МПК оцінюють ступінь чутливості досліджуваних штамів до конкретного препарату.
Таблиця 9
Приграничні (критичні) значення діаметрів зон
затримки росту, їх кореляція з МПК і рівняння регресії
для визначення чутливості до антибіотиків вібріонів
Антибіотик |
Вміст антибіотика в диску, мгк |
Приграничні значення |
діаметрів зон затримки росту в (мм) для штамів |
МПК (в мкг/мл) для штамів |
стійких |
помірно стійких |
чутливих |
стійких |
чутливих |
Тетрациклін |
30 |
16 |
17-21 |
22 |
12 |
4 |
Левоміцетин |
30 |
17 |
18-20 |
21 |
16 |
8 |
Ампіцилін |
30 |
14 |
15-18 |
19 |
32 |
8 |
Стрептоміцин |
30 |
16 |
17-20 |
21 |
16 |
6 |
Неоміцин |
30 |
16 |
17-20 |
21 |
32 |
8 |
Канаміцин |
30 |
16 |
17-20 |
21 |
24 |
6 |
Гентаміцин |
10 |
17 |
18-19 |
20 |
6 |
4 |
Поліміксин М |
300 ОД |
9 |
10-12 |
13 |
50 ОД |
- |
Еритроміцин |
15 |
20 |
21-25 |
26 |
8 |
2 |
Рифампіцин |
5 |
19 |
20-24 |
25 |
8 |
2 |
4.7. Порядок контролю якості діагностичних поживних середовищ.
4.7.1. Готові поживні середовища, консерванти, інгібітори сторонньої мікрофлори, якими користуються в діагностиці холери, підлягають обов'язковій перевірці з метою контролю якості приготування на місцях (сухі середовища промислового виготовлення) або визначення їх чутливості, інгібуючих або консервуючих властивостей (середовища лабораторного приготування).
4.7.2. Бактеріологічний контроль якості твердих та рідких поживних середовищ можуть проводити лабораторії протичумних та інших закладів, які мають дозвіл на роботу із збудником холери, використовуючи для контролю тест-штами Vibrio cholerae cholerae P-1 (145) і Vibrio cholerae eltor M-878, а також лабораторії особливо небезпечних інфекцій обласних санепідстанцій, відомчих установ з використанням тест-штаму авірулентного холерного вібріону не 01 серогрупи Р-9741 (Ростов, Росія).
4.7.3. Бактеріологічному контролю підлягає кожна серія сухого середовища промислового випуску, яка має контрольний N ВБК і відповідний термін придатності, а також середовища лабораторного приготування.
4.7.4. При позитивному результаті контролю проби відповідна серія середовища вважається придатною до реалізації, при цьому серія промислового пуску тільки при тих же умовах виготовлення.
Наступний контроль цієї серії середовища здійснюється щорічно, а також при зміні умов варки середовищ, незалежно від часу попередньої перевірки.
4.7.5. Термін зберігання готового лужного агару та розчину основного пептону - 12 місяців від часу перевірки. По закінченню цього терміну середовище підлягає додатковому контролю не рідше 1 разу на квартал. При позитивному результаті контролю промислової серії середовища по закінченню встановленого терміну зберігання термін пригодності його продовжують на 6 місяців.
4.7.6. Якщо при першому контролі середовище було непридатне, необхідно провести повторно бактеріологічний контроль цієї ж серії сухого середовища і взірець нової варки з нього:
- при отриманні негативного результату повторного контролю середовища, приготовленого на місці, і позитивного бактеріологічного контролю взірця цієї серії сухого середовища, звареного в лабораторії установи, яка веде контроль вважати дану серію сухого поживного середовища придатною і вжити заходи щодо усунення помилки в технології місцевого приготування;
- при отриманні негативного результату на взірець сухого середовища даної серії направляють рекламацію до адреси установи, яка готувала поживне середовище.
4.7.7. На перевірку надсилають частину загального об'єму середовища, яке призначене для проведення досліджень, в кількості 200 мл агару і 100 мл основного розчину пептону промислового виготовлення і в подвійному об'ємі для серій лабораторного приготування. На етикетці вказати назву середовища, номер серії, термія придатності сухого середовища і дату контрольної варки.
4.7.8. Оптимальний строк перевірки поживного середовища 10-14 днів після його приготування.
4.7.9. Лужний агар і основний розчин пептону, які приготовлені з сухих поживних середовищ промислового випуску, перевіряють з використанням однієї дози (10^6 м.кл.) одного тест-штаму (Vibrio cholerae cholerae P-l 145 або Vibrio cholerae не 01 9741).
Для контролю середовища використовують 3-годинну культуру тестштаму, яка вирощена на агаровому середовищі, розлитому в чашки за 30-40 хвилин до посіву 18-20 - годинної агарової культури II-IV пасажу.
З робочої культури готовлять суспензію в 0,9 % розчину хлористого натрію pH (7,1+/-0,1) концентрації 1 млрд. м.кл. в 1 мл по стандарту мутності 5 одиниць ІСК ім. Л.А. Тарасевича (Росія).
Приготовлену суспензію поступово розводять переносом по 0,5 мл в 4,5 мл 0,9 % хлористого натрію до концентрації 100 м.кл. в 1 мл (8-а пробірка, розведення 10^7).
Для контролю лужного агару 10 м.кл. тест-культури ( 0,1 мл з розведення 10^7) засівають на кожну з 3 чашок (свіжовиготовлених і ретельно підсушених) середовища, яке перевіряється і контролюється, і 1000 м.кл. (0,1 мл з розведення 10^6) - тільки на контрольну. Для останньої використовують перевірений якісний лужний агар. Посівний матеріал розтирають шпателем і інкубують при температурі (37+/-0,5 о C) на протязі 12 годин.
Результати перевірки оцінюють по показниках росту колоній тесткультури на досліджуваному контрольному середовищах з оцінкою фактичної величини посівної дози: - досліджуване тверде поживне середовище придатне для виділення збудника холери, якщо після 12 годин інкубації при температурі (37+/-0,5 о C) на всіх чашках ростуть типові по морфології колонії діаметром не менше 1 мм.
4.7.10. Основний розчин виробничого випуску, який необхідно перевірити, і використаний в якості контрольного середовища, розводять до 1 % концентрації, встановлюють pH (8,3+/-0,1) і розливають в колби або флакони по 100 мл кількості 3 – для дослідного і 6 - контрольного. У всі робочі об'єми дослідного і 3 об'єми контрольного середовища наносять по 10 м.кл. тесткультури (0,1 мл пробірка N 8, розведення 10^7) і по 100 м.кл. (0,1 мл пробірка N 7, розведення 10^6) в другі 3 об'єми контрольного середовища.
Таблиця 10
Показники межевих значень мінімальних пригнічуючих
концентрацій для визначення груп мікроорганізмів по
ступеню чутливості до антибактеріальних препаратів
в мкг/мл або ОД/мл
Антибіотик та хіміопрепарату |
Межеві значення МПК відповідно: |
чутливим культурам |
стійким культурам |
АНТИБІОТИКИ |
|
|
Азлоцилін |
<8 |
>64 |
Ампіцилін |
<8 |
>32 |
Амікацин |
<16 |
>32 |
Бензилпеніцилін |
<1 |
>8 |
Гентаміцин |
<4 |
>8 |
Доксіциклін |
<4 |
>16 |
Канаміцин |
<16 |
>32 |
Карбеніцилін |
<16 |
>32 |
Левоміцетин |
<16 |
>32 |
Рифампіцин |
<2 |
>16 |
Стрептоміцин |
<6 |
>16 |
Сизоміцин |
<3 |
>8 |
Тетрациклін |
<4 |
>16 |
Еритроміцин |
<2 |
>8 |
Цефогаксим |
<8 |
>32 |
Цефалотін |
<8 |
>32 |
ХІМІОТЕРАПЕВТИЧНІ ПРЕПАРАТИ |
|
|
Сульфаніламіди |
<256 |
>512 |
Сульфатон |
<2/38 |
>4/76 |
Триметоприм |
<8 |
>16 |
Налідиксова кислота |
<15 |
>32 |
Ципрофлоксацин |
<4 |
>8 |
Метранідазол |
<4 |
>64 |
Нітрофуран |
<4 |
>128 |
Для контролю посівної дози по 0,1 суспензії тест-культури розведення 10^7 і 10^6 (10 і 100 м.кл.) переносять на чашки контрольного лужного агару (по 3 на кожну дозу), рівномірно розподіляють і інкубують при температурі (37+/-0,5о C) 12-14 годин. Посіви в 1 % пептонній воді інкубують на протязі 6 годин при температурі (37+/-0,5о C) з наступним висівом з поверхневого шару кожного петлею N 5 (5 мм) на агарові пластинки контрольногосередовища і після вирощування при температурі (37+/-0,5 о C) на протязі 12-14 годин враховують результати:
- перевірочний основний розчин пептону вважають придатним для виділення збудників холери, якщо з усіх посівів 10 м.кл. тест-культури в 1 % пептонну воду з 6-годинною інкубацією на агарових пластинках виростають типові по морфології колонії діаметром не менше 1 мм;
- у всіх посівах з контрольного середовища збагачення повинні рости типові колонії діаметром не менше 1 мм в кількості одиничних для посівної дози 10 м.кл. і не менше 10 для дози 100 м.кл.;
- в посівах, що контролюють величину використаної в дослідженні посівної дози тест-культури, повинні рости типові і поодинокі колонії (не більше 5) для посівної дози 10 м.кл. не менше 30, але не більше 50 (середнє число на 1 чашку) для дози 100 м.кл.;
- основний розчин пептону слід признати непридатним для виділення збудників холери, якщо при відповідності з вимогами величини посівної дози і якості контрольних поживних середовищ колонії тест-культур виростають менше ніж на 3 чашках або діаметром менше 1 мм;
- при невідповідності контрольних показників дослід повторюють.
4.7.11. Бактеріологічний контроль поживних середовищ з інгібіторами сторонньої мікрофлори, сольових консервантів по "Інструкції по бактеріологічному контролю діагностичних поживних середовищ для холерного вібріону"
(Росія, 1983 р.).
4.7.12. При здійсненні всіх видів бактеріологічного контролю поживних середовищ обов'язково дотримуватися вимог до тест-штамів, порядку їх зберігання і підготовки робочої культури, які визначені вищеназваною інструкцією.
4.7.13. Полівуглеводні середовища, які використовують для відбору колоній для ідентифікації, перевіряють на місцях з використанням штамів холерних вібріонів не 01 або кишкової палички.
4.8. Забезпечення біологічної безпеки в лабораторіях, які виконують дослідження на холеру.
4.8.1. Діагностичні дослідження на холеру в регламентуючому об'ємі можуть проводити лабораторії, які мають дозвіл:
- бактеріологічні лабораторії територіальних санепідстанцій, лікувально-профілактичних та відомчих закладів - на роботу з мікроорганізмами III групи патогенності;
- лабораторії протичумних закладів та лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій санепідстанцій (республіканської, обласних, міських), - на проведення діагностичних досліджень на холеру та на роботу із збудниками холери;
- в умовах епідемічних ускладнень тимчасовий дозвіл на проведення діагностичних досліджень на холеру бактеріологічними лабораторіями територіальних санепідстанцій, які функціонують в складі лабораторної служби вогнища, видають територіальні режимні комісії.
4.8.2.
Порядок отримання дозволу для всіх лабораторій визначений наказом МОЗ України
"Про посилення роботи ре