ЗАТВЕРДЖЕНО
наказом МОЗ України
від 30.05.1997 р. N 167
Інструкція
по організації та проведенню
протихолерних заходів, клініці та лабораторній діагностиці холери
5. Серологічні методи дослідження.
Для серологічної діагностики холери використовують імунологічні реакції, які виявляють в сироватці хворих, перехворілих, вібріононосіїв, а також у вакцинованих специфічні антитіла: аглютиніни, вібріоцидіни, антитоксини. Постановка реакцій проводиться в мікро- або макрооб'ємах (згідно з наставленням).
У хворих холерою на 5-7-й день після початку захворювання з'являються аглютиніни та вібріоцидні антитіла в високих титрах.
Титри антитоксинів наростають більш повільно.
Досліджувати потрібно парні сироватки з інтервалом в 7-10 днів. Першу пробу потрібно забирати на 3-5 день хвороби.
Кров для серологічних досліджень забирають з вени, а при відсутності такої можливості або при роботі в польових умовах – з пальця. З вени беруть 1-5 мл крові і після згортання згусток відділяють від стінок пробірки стерильною скляною паличкою або платиновою петлею. Пробірки зберігають в холодильнику і транспортують в лабораторію охолодженими (в термосі, сумці - холодильнику та ін.). В лабораторії сироватку інактивують при температурі (56+/-0,5 о C) 30 хв.
Якщо кров забирають в день постановки реакції, пробірки з кров'ю, що згорнулась, необхідно центрифугувати 10-15 хв. при 3000 об/хв. При відсутності можливості досліджувати сироватку терміново її зберігають в ампулах при температурі 4 о C. Кров з пальця беруть в об'ємі 0,4 мл і вносять в стерильний пеніциліновий флакон або пробірку
з 1,6 мл фізіологічного розчину (1:5).
При роботі в польових умовах декілька крапель капілярної крові з пальця наносять на стерильний папір, підсушують при кімнатній температурі поміщають в пробірку і направляють в лабораторію. При дослідженні кружальця паперу з краплями крові вирізають і кожен з них заливають 0,9 мл стерильного 0,9 % розчину хлористого натрію (розведення 1:10) і після 3-4 годин екстрагування в умовах холодильника інактивують 30 хв. При
температурі (56+/-0,5 о C) і досліджують.
5.1. Визначення аглютинінів в сироватці крові.
5.1.1. Виявлення протихолерних антитіл методом розгорнутої реакції аглютинації.
Сироватку, яку досліджують, розводять 1 % пептонною водою pH 7,3+/-0,1 в об'ємі 1 мл від 1:10 до 1:640. Як антиген використовують 3-годинну бульйонну культуру, яку виявили в даному вогнищі, або досліджують в 2-х рядах з культурами сероварів Огава і Інаба. В пробірку з розтитрованою сироваткою вносять по 1 краплі культури-антигена і ставлять на 1 годину в термостат, потім до ранку в холодильник при температурі (4+/-0,5 о C), після чого реєструють результати. Реакція супроводжується контролями антигену та сироватки.
При визначенні титру реакції враховують розведення з аглютинацією на 3-4 хрести. Результат дослідження сироватки хворого при позитивній реакції аглютинації в розведенні 1:40 і вище вважається орієнтовано позитивною. Діагностичне значення має не менше чим 4- кратне нарощування титру антитіл.
5.1.2. Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з антигенним холерним еритроцитарним діагностикумом. РНГА призначена для виявлення повних антитіл в сироватці крові. Це достатньо специфічна та чутлива двокомпонентна реакція. РНГА має значну перевагу над реакцією аглютинації. Необхідні інгредієнти, методика постановки в макро- та мікрооб'ємах подані в наставленні до діагностикуму холерного антигенного еритроцитарного.
5.1.3. Реакція нейтралізації антигену (РНАг) для виявлення антитіл в сироватці крові з використанням холерного імуноглобулінового еритроцитарного діагностикума. РНАг - високоспецифічна трикомпонентна реакція. Принцип реакції полягає в специфічній нейтралізації антигену, який додається повними та неповними антитілами, які знаходяться в сироватці. Необхідні інгредієнти, методика постановки в макро- і мікрооб'ємах подані в наставленні до діагностикуму холерного імуноглобулінового еритроцитарного. При використанні системи реакцій РНГА і РНАг необхідність постановки контролю специфічності з кожною досліджуваною сироваткою випадає, так як ці 2 реакції взаємно контролюють отримані результати. Діагностичне значення має не менше ніж 4-кратне наростання титрів антитіл при дослідженні парних сироваток в РНГА і РНАг.
5.2. Визначення токсиннейтралізуючих антитіл в сироватці крові.
РНГА з еритроцитарним холерним ентеротоксичним діагности кумом (ЕХЕД), призначеним для визначення в сироватці крові хворих холерою, вібріононосіїв та щеплених холероген-анатоксином антитіл, які нейтралізують холерний токсин. Токсиннейтралізуючі антитіла з'являються на 5-6-й день хвороби, досягають максимума на 14-21-й день, а потім їх титри знижуються. Діагностичним титром РНГА з ЕХЕД слід вважати 1:160. Доцільно досліджувати парні сироватки.
За допомогою цієї реакції можна також виявляти токсиннейтралізуючі антитіла в сироватці крові хворих та вібріононосіїв, у яких інфікування обумовлене холерним вібріоном 0139 серогрупи. Методика постанови РНГА і ЕХЕД додається до комплекту діагностикума.
5.3. Визначення вібріоцидних антитіл в сироватці крові (РВА).
Вібріоцини в крові хворих визначаються з 1-3-го дня захворювання в титрах 10^1 - 10^3 і досягають максимального значення 10^-4 - 10^-8 до 10-12 дня. Основа методу полягає в тому, що в присутності вібріоцидних антитіл не розмножуються холерні вібріони.
При проведенні серологічних досліджень у вогнищі, зумовленим збудником холери відповідного серовару, в реакції використовують один штам відповідного серовару, при відсутності цих даних – два штами обох сероварів.
У перехворілих титр вібріоцидних антитіл може бути від 10^-4 до 10^-6 в перші 3- 4 тижні, а вакцинованих - 10^-4 - 10^-7 та вище.
5.3.1. Матеріали та обладнання методу: - досліджуємі сироватки, інактивовані прогрівом 30 хв. при температурі (56+/-0,5о C); - сухий комплемент або свіжоотримана сироватка морської свинки в розведенні 1:20; - 0,9 % розчин хлориду натрію pH (7,2+/-0,1); - штами холерних вібріонів сероварів Огава та Інаба, типові, в S-формі, не чутливі до комплементу; - чашки Петрі з лужним агаром; посудина з льодом; - термостат на 37 о C.
5.3.1.2. Методика постановки реакції. Комплемент, розведений фізіологічним розчином 1:20, розливають в 2 ряди пробірок по 0,9 мл. В першу пробірку вносять 0,1 мл досліджуваної сироватки і після ретельного перемішування послідовно переносять по 0,1 мл до розведення 10^-10, отримують десятикратні розведення в об'ємі 0,9 мл. Титрацію сироватки проводять на льоду, який кладуть в будь яку ємкість.
З однодобової агарової культури холерного вібріону готують суспензію в фізіологічному розчині, яка вміщує в 1 мл 10000-20000 м.кл. Стерильною градуйованою піпеткою отриману суспензію по 0,1 мл вносять в дослідні пробірки з розтитрованою сироваткою.
Необхідні контролі:
а) контроль комплементу (0,9 мл комплементу і 0,1 мл культури);
б) контроль сироватки (0,8 мл фізіологічного розчину, 0,1 мл сироватки і 0,1 мл культури);
в) контроль культури (0,9 мл фізіологічного розчину і 0,1 мл культури).
Штатив з пробірками на 1 годину ставлять у водяну баню або термостат при температурі (37+/-0,5 о C), завчасно роблять висів з пробірки контролю культури для визначення фактичної концентрації живих вібріонів в дослідній суспензії (контроль розведення), через 1 годину штатив знову ставлять на лід і з кожної пробірки окремою стерильною піпеткою 0,1 мл культури висівають на чашку з лужним агаром pH (7,7+/-0,1). Посів рівномірно розподіляють по поверхні чашки гойданням її або шпателем. Чашки ставлять на 18-24 години в термостат при температурі (37+/-0,5 о C), після чого підраховують кількість вирощених колоній.
В посівах з контрольних пробірок повинна вирости кількість колоній, близька до контролю розведення.
5.3.1.3. Вібріоцидним титром вважають максимальне розведення сироватки, яке викликає загибель не менше чим 50 % клітин холерного вібріону, що виявляється при посіві на агарові пластинки в чашки Петрі в порівнянні з кількістю вирощених колоній з пробірки контролю комплементу.
Приклад обчислення: при посіві з дослідних пробірок з розведенням сироватки 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 т.п. на чашках відповідно виросло 0; 5; 10; 15; 30; 38 і т.д. колоній. При висіві з пробірки контролю комплементу також після годинної інкубації при температурі (37+/-0,5 о C) виросло 36 колоній, 50 % від цього числа буде 18. З 5-ї пробірки виросло 15 колоній, тобто менше 50 % від кількості колоній в контролі (18), в наступній - 30, тобто більше 50 % цього показнику. Розведення сироватки в 5-й пробірці буде 10^-5, таким чином вібріоцидний титр в даному прикладі буде 10^-5.
5.3.2. Визначення вібріоцидних антитіл (ВА) в сироватці крові на основі ферментації вуглеводів. Про відсутність або наявність ВА судять по ферментації сахарози, що визначають за допомогою індикатору.
Матеріали та обладнання.
- сироватка крові, взята з вени або пальця, інактивована при (56+/-0,5 о C);
- штами холерного вібріону сероварів Огава і Інаба,
- комплемент, розведений 1:20 1 % пептонною водою, який містить 1 % сахарози і 1 % індикатора Андреде;
- термостат на (37+/-0,5 о C).
Методика постановки реакції. Комплемент, розведений 1:20 1 % пептонною водою з сахарозою та індикатором Андреде, розливають в пробірки по 0,45 мл. В першу пробірку добавляють 0,05 мл досліджуваної сироватки і після ретельного перемішування переносять 0,5 мл суміші в другу пробірку, з другої в третю і т.п. (до розведення 10^-8 - 10^-9). Готують суспензію з 18-20 - годинної агарової культури холерного вібріону і розводять 1 % пептонною водою до концентрації 10^3 м.кл. в 1 мл. У всі пробірки вносять по 0,45 мл суспензії і вміщують в термостат.
Постановку реакції супроводжують контролями.
- 0,45 мл 1 % пептонної води, яка містить 1 % сахарози і 1 % індикатора Андреде + 0,05 мл досліджуваної сироватки + 0,45 мл суспензії культури - контроль сироватки;
- 0,45 мл комплементу з сахарозою і індикатором + 0,45 мл культури - контроль комплементу;
- 0,45 мл 1 % пептонної води з сахарозою і індикатором + 0,45 мл культури - контроль культури;
- 0,45 мл 1 % пептонної води з сахарозою і індикатором + 0,05 мл досліджуваної сироватки - контроль стерильності сироватки.
Через 7-8 годин проводять облік реакції. При цьому в контролі (крім контролю стерильності сироватки) колір вмісту пробірок повинен перейти в червоний або рожевий. Зміна кольору індикатору в пробірках робочого ряду, пов'язаного з ферментацією сахарози розмноженими вібріонами, свідчить про відсутність вібріоцидних антитіл в досліджуваній сироватці. За вібріоцидний титр приймають те найбільше розведення сироватки, при якому колір вмісту пробірки залишається незмінним або інтенсивність його значно відрізняється від кольору контрольних проб. Результат виражають у вигляді десятичного логарифму розведення сироватки, взятого з протилежним знаком.
Примітка. Тест вібріоцидних антитіл при холері, обумовлених вібріонами 0139 серогрупи, в зв'язку резистентністю їх до комплементу не рекомендується використовувати.