Додаток 5
1. Визначення ростових властивостей тіогліколевого середовища
Для визначення ростових властивостей тіогліколевого середовища використовують тест-культури мікроорганізмів:
Staphylococcus aureus 209 P
Clostridium sporogenes 272.
1.1. Вирощування та зберігання тест-культур
1.1.1. Staphylococcus aureus 209 P
Відкривають ампулу з ліофілізованою культурою Staphylococcus aureus 209 P, стерильною пастерівською піпеткою додають 0,5 мл бульйону Хоттінгера або м'ясо-пептонного бульйону (додаток 2), ретельно перемішують до отримання гомогенної суспензії і переносять у пробірку з аналогічним середовищем. Посіви інкубують за температури від 30 до 35 о C протягом (21 ± 3) год. Потім культуру пересівають на чашки Петрі з агаром Хотгінгера або м'ясо-пептонним агаром, інкубують за вказаними вище умовами, виділяють типові колонії (гладенькі, з рівними краями, золотисто-жовтого кольору) і пересівають їх на скошений агар Хоттінгера або м'ясо-пептонний агар. Посіви інкубують у термостаті за температури від 30 до 35 о C протягом (21 ± 3) год., потім витримують (21 ± 3) год. за кімнатної температури.
Культуральні властивості: культура на поверхні агару росте у вигляді рівного нальоту або гладеньких колоній з рівномірною золотисто-жовтою пігментацією.
Морфологічні властивості: в мазку, забарвленому за Грамом, повинні спостерігатись однорідні за розміром і розташовані у вигляді грона коки з добре виявленим грампозитивним забарвленням.
Культуру пересівають для зберігання в 5 - 10 пробірок, які вміщують по 10 мл напіврідкого агару. Посіви інкубують у термостаті за температури від 30 до 35 о C протягом (21 ± 3) год. Потім пробки пробірок парафінують і закривають гумовими ковпачками. Після вирощування в термостаті культуру зберігають за температури від 2 до 10 о C. Пересіви проводять не рідше одного разу на 4 міс.
1.1.2. Clostridium sporogenes 272
Відкривають ампулу з ліофілізованою культурою Clostridium sporogenes 272, стерильною пастерівською піпеткою додають 1 мл попередньо регенерованого середовища Кітта-Тароцці (додаток 2), ретельно переміщують і гомогенну суспензію переносять у дві пробірки з тим же середовищем (посівний матеріал вносять на дно пробірки без видування). Посіви інкубують за температури від 30 до 35 о C протягом (21 ± 3) год.
Культуральні властивості: культура в напіврідкому середовищі, спочатку викликає дифузне помутніння, потім утворюються осад і надосадовий прозорий шар поживного середовища.
Морфологічні властивості: в мазку, забарвленому за Грамом, повинні спостерігатись великі грампозитивні спорові палички. Спори овальної форми, розташовуються субтермінально.
Культуру переносять для зберігання в 5 - 10 пробірок, які вміщують по 10 мл регенерованого середовища Кітта-Тароцці.
Для визначення чистоти культури у разі всіх пересівів рекомендується проводити висів на скошений агар Хоттінгера. Посіви інкубують у термостаті за температури від 30 до 35 о C.
Пробірки з культурою (друга генерація) запаюють або заливають поверх посіву шаром стерильного вазелінового масла висотою (1,5 ± 0,1) см. На пробки пробірок, у яких знаходиться культура, одягають гумові ковпачки.
Культури зберігають за температури від 2 до 10 о C і пересівають на таке ж середовище не рідше одного разу на 4 міс.
1.2. Підготовка тест-штамів мікроорганізмів для контролю тіогліколевого середовища
1.2.1. Staphylococcus aureus 209 P
(21 ± 3)-годинну культуру Staphylococcus aureus 209 P, що була вирощена на скошеному агарі Хоттінгера або м'ясо-пептонному агарі (друга генерація), змивають з поверхні агару стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду (1,0 ± 0,1) мл і ретельно перемішують за допомогою стерильної піпетки. Потім деяку кількість одержаної суспензії переносять у порожню стерильну пробірку, доводять концентрацію мікробної зависі до 10 одиниць за стандартним зразком (ОСО 42-28-59-85).
Підведену до стандарту суспензію культури Staphylococcus aureus 209 P у кількості 1 мл переносять у першу з 8 пробірок, які вміщують по 9 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду.
Це перше розведення тест-культури - 10^-1. Таким же чином послідовно отримують десятикратне розведення культури до восьмої пробірки (розведення 10^-8).
Для переносу зависі культури з однієї пробірки в іншу кожного разу необхідно користуватись окремою стерильною піпеткою об'ємом 1 мл.
Для контролю тіогліколевого середовища використовують розведення культури Staphylococcus aureus 209 P 10^-6, 10^-7, 10^-8.
1.2.2. Clostridium sporogenes 272
Культуру Clostridium sporogenes 272, що була вирощена в середовищі Кітта-Тароцці (друга генерація)*, центрифугують у разі швидкості обертання під 2700 до 3000 об./хв. протягом (20 ± 1) хв., потім видаляють надосадову рідину.
* Для вирощування добової робочої культури Cl. sporogenes 272 можна використовувати тіогліколеве середовище, відконтрольоване за всіма показниками.
Одержану в осаді біомасу розводять стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду до концентрації мікробної зависі, яка відповідає 10 одиницям за стандартним зразком мутності (ОСО 42-28-59-85). Під час роботи з анаеробною культурою перемішування здійснюють за допомогою піпетки. Для того, щоб уникнути попадання повітря в культуру, піпетку не виймають із рідини.
1 мл одержаної суспензії клітин стерильною піпеткою переносять у стерильну пробірку, яка вміщує 9 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду (розведення 10^-1). Одержану завись культури доводять до розведення 10^-8 десятикратними розбавленнями. Для контролю поживного середовища використовують розведення культури Clostridium sporogenes 272 10^-6, 10^-7, 10^-8.
1.3. Посів тест-штамів мікроорганізмів у тіогліколеве середовище і облік результатів
По 0,1 мл мікробної зависі Staph. aureus 209 P (кожне з розведень 10^-6, 10^-7, і 10^-8) і Cl. sporogenes 272 (кожне з розведень 10^-6, 10^-7, 10^-8) вносять відповідно в три пробірки, що містять по 10 мл тіогліколевого середовища, занурюючи піпетку в середину стовпчика середовища. Посіви здійснюють починаючи з останнього розведення. Через (21 ± 3) год. і (45 ± 3) год. інкубації в термостаті за температури від 30 до 35 о C проводять облік результатів.
Серію середовища визнають придатною за ростовими властивостями, якщо не пізніше (45 ± 3) год. інкубації посівів візуально виявляється ріст тест-культур Staph. aureus 209 P та Cl. sporogenes 272 із розведення 10^-7 не менше ніж у 2 із 3 засіяних пробірок.
Припускається можливість признати придатною серію середовища за таких результатів росту тест-штамів:
10^-6 - не менше ніж у 2 пробірках;
10^-7 - не менше ніж в 1 пробірці;
10^-8 - не менше ніж в 1 пробірці.
Якщо по закінченні гарантійного терміну якість поживного середовища не знизилась, воно підлягає подальшому використанню після переконтролю. Переконтроль середовища проводять у бактеріологічній лабораторії станції переливання крові.
У разі одержання позитивних результатів термін придатності поживного середовища подовжують на 1 рік.