ІНСТРУКЦІЯ
з визначення імунних антитіл групової системи AB0
Антитіла системи AB0 - ізоаглютиніни a(альфа) і b(бета) у людей є нормальними (природними) антитілами. Вони належать до повних антитіл-аглютинінів, добре реагують у сольовому середовищі, краще виявляються при кімнатній температурі +(22 ± 2) о C і погано - при температурі +37 о C. Додавання в реакцію колоїдних речовин не посилює активності цих антитіл, непряма проба Кумбса їх не виявляє.
Нормальні антитіла a(альфа) і b(бета) легко абсорбуються груповими субстанціями A і B. Вони чутливі до дії високої температури: прогрівання при температурі 70 о C протягом 10 хв. достатньо, щоб антитіла повністю втратили активність.
Крім нормальних (природних) антитіл a(альфа) і b(бета) в людини можуть з'явитися імунні антитіла анти-A і анти-B. Імунні антитіла практично відсутні в крові людей, але можуть з'явитися внаслідок ізоімунізації у разі парентерального попадання в організм несумісного в груповому відношенні антигену, наприклад, у разі AB0-несумісної вагітності, під час помилкового переливання крові, несумісної за системою AB0, а також під час проведення деяких щеплень та імунізації.
У разі AB0 - несумісної вагітності, яка стала причиною гемолітичної хвороби плода, імунні антитіла анти-A або анти-B майже завжди наявні в крові матері до моменту народження хворої дитини. Звичайно це супроводжується високим титром нормальних антитіл a(альфа) і b(бета).
Після помилкового переливання несумісної крові імунні антитіла анти-A і анти-B з'являються звичайно на 5-ту - 7-му добу, досягаючи максимуму до 15 - 25-ї доби з наступним зниженням їх титру. У крові таких хворих одночасно підвищується титр нормальних антитіл a(альфа) і b(бета) на 3 - 8 ступенів також з наступним зниженням після 25 - 30-ї доби.
Імунні антитіла анти-A і анти-B можуть бути як у формі повних, так і неповних антитіл. Вони активні при температурі 37о C, можуть мати дещо більш високий титр у разі проведення реакції в колоїдному середовищі порівняно з сольовим і виявляються в непрямій пробі Кумбса. Імунні антитіла не абсорбуються при додаванні групонеспецифічної субстанції. Вони стійкі до температурного впливу і зберігають активність під час прогрівання сироватки протягом 10 хв. при температурі 70оC, тобто за умов, коли нормальні антитіла a(альфа) і b(бета) повністю інактивуються.
Виявлення імунних антитіл може бути цінною діагностичною ознакою, зокрема, при вирішенні питання про причини гемотрансфузійних ускладнень і гемолітичної хвороби новонароджених. Ці дослідження рекомендують для використання на практиці. Найбільш демонстративною відмінністю нормальних антитіл a(альфа) і b(бета) від імунних антитіл анти-A і анти-B є їх поведінка під дією високої температури.
На врахуванні цих відмінностей грунтується застосування різних методів для виявлення нормальних антитіл та імунних антитіл анти-A і анти-B.
1. Визначення повних імунних антитіл системи AB0 за допомогою реакції сольової аглютинації
1.1. Підготовка до роботи
Стандартні еритроцити (або суміш еритроцитів) груп A(II) і B(III) двічі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду шляхом центрифугування, при швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі, після чого на дні пробірки залишається еритроцитна маса, з якої готують 2 - 3% завис окремо кожної групи.
Досліджувану сироватку в кількості 0,5 мл розводять у чотири рази 0,9% розчином натрію хлориду, щоб уникнути коагуляції під час нагрівання, потім розливають порівну в дві пробірки, одну з них прогрівають протягом (10 ± 1) хв. при температурі +(70 ± 0,5)о C, точно дотримуючи температуру і час.
Таким чином, отримуємо дві порції сироватки - нативної і прогрітої, кожна з яких розведена 1:4.
Визначення антитіл починається реакцією аглютинації в сольовому середовищі в маленьких пробірках. Якщо цим методом повних імунних антитіл не виявлено, дослідження далі доповнюють непрямою пробою Кумбса.
1.2. Техніка визначення повних антитіл у реакції аглютинації в сольовому середовищі в маленьких пробірках
Під час дослідження сироватки групи A(II) або B(III) в штативі розміщують в один ряд 12 маленьких пробірок. У разі дослідження сироватки групи 0(I) - два ряди по 12 пробірок. Штатив попередньо накривають аркушем паперу, в якому проколюють отвори для пробірок. У разі дослідження крові вагітної жінки використовують для дослідження еритроцити її чоловіка. Під час дослідження сироватки породіллі використовують еритроцити її дитини.
На папері надписують прізвище і групу крові особи, чию сироватку досліджують, групу крові стандартних еритроцитів і на кожній пробірці - ступінь розведення сироватки (1:4; 1:8; 1:16 і т. д. до 1:8000).
У всі пробірки кожного ряду, починаючи з другої, накапують по 2 краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Потім у першу і в другу пробірки (кожного ряду) накапують по дві краплі приготовленої непрогрітої сироватки, розведеної в чотири рази.
У другій пробірці кожного ряду сироватку змішують з 0,9% розчином натрію хлориду і дві краплі цієї суміші переносять у третю пробірку, з третьої (також після перемішування) - в четверту і т. д. до останньої, з якої дві краплі виливають. Таким чином у пробірках утворюється розведення сироватки від 1:4 до 1:8000.
У другому штативі готують розведення попередньо прогрітої сироватки, за такої умови достатньо розмістити по 6 пробірок (розведення сироватки від 1:4 до 1:128).
Після приготування розведеної сироватки у всі пробірки додають по одній краплі 2 - 3% завису стандартних еритроцитів іншої групи: якщо досліджується сироватка групи B(III) - еритроцити групи A(II), якщо сироватка A(II) - еритроцити групи B(III) і у разі дослідження сироватки групи 0(I) в один ряд пробірок додають еритроцити групи A(II), а в другий ряд - еритроцити групи B(III).
Вміст пробірок старанно перемішують, після чого штативи залишають в спокої на 1 год.: з нативною сироваткою – при кімнатній температурі, з прогрітою - при температурі 37 о C.
Результат оцінюють за формою осаду еритроцитів на дні пробірки, проглядаючи його над джерелом світла через лупу з 6 - 8-кратним збільшенням.
За наявності аглютинації осад розміщується у вигляді грудочок нерівномірним шаром із зігнутими, інколи загорнутими всередину, краями. За умови відсутності аглютинації осад еритроцитів розміщується рівномірним шаром у центрі дна пробірки у вигляді правильно окресленого кола.
Результати зазначають на папері біля кожної пробірки знаком (+) або (-).
Наявність аглютинації свідчить про присутність повних антитіл, а останнє розведення, у якому вона спостерігається, - про їх титр.
Титр антитіл нативної (не прогрітої) сироватки відноситься до аглютинінів (a(альфа) і b(бета), титр антитіл в прогрітій сироватці - до імунних антитіл анти-A (або анти-B).
У тому випадку, коли аглютинація спостерігається у всіх пробірках, дослідження треба повторити, продовжуючи розведення сироватки.
Негативний результат у всіх пробірках з прогрітою сироваткою свідчить про відсутність повних імунних антитіл.
2. Визначення неповних імунних антитіл системи AB0 непрямою пробою Кумбса
2.1. Підготовча робота
Стандартні еритроцити A(II) і B(III) двічі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду (п. 1.1), після чого на дні пробірок залишаються еритроцити, які використовують для дослідження.
2.2. Техніка реакції
У разі дослідження сироватки A(II) або B(III) в штатив вставляють 6 пробірок, при дослідженні сироватки групи 0(I) – два ряди по 6 пробірок. Пробірки нумерують. Штатив попередньо накривають аркушем паперу, в якому роблять отвори для пробірок. На папері роблять позначки, вказуючи на кожній пробірці її номер та всі інші відомості, як сказано вище, для реакції сольової аглютинації.
У всі пробірки, починаючи з N 2, накапують по три краплі (0,15 мл) 0,9% розчину хлориду натрію, а потім у пробірки N 1 і N 2 - по три краплі (0,15 мл) досліджуваної, заздалегідь прогрітої, сироватки і далі готують її розведення, як це зазначено вище, для методу сольової аглютинації, але в об'ємі трьох крапель.
У всі пробірки пастерівською піпеткою додають по одній маленькій краплі (0,01 мл) еритроцитів іншої групи, змішують сироватку з еритроцитами і штатив ставлять для інкубації в термостат на 45 хв. при температурі 37 о C. За цей час імунні антитіла, якщо вони є в сироватці, фіксуються на еритроцитах.
Після інкубації відмивають еритроцити, для чого в пробірки доливають 0,9% розчин натрію хлориду, перемішують вміст і центрифугують при швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Надстійну рідину відливають. Таке відмивання повторюють тричі (при об'ємі пробірок 10 мл достатньо дворазового відмивання).
Після відмивання в кожну пробірку додають 3 – 5 (0,15 - 0,25 мл) крапель 0,9% розчину натрію хлориду для одержання приблизно 5% завису еритроцитів і з кожної пробірки по одній краплі такого завису переносять на білу пластинку, яка має змочувану поверхню, пронумерувавши попередньо місця на пластинці відповідно до номерів пробірок. До кожної краплі додають по одній краплі сироватки для проби Кумбса і перемішують їх скляною паличкою. Далі протягом 10 хв. спостерігають результат при періодичному похитуванні пластинки.
2.5. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації, яку видно неозброєним оком на білому тлі пластинки.
Настання аглютинації позначають на папері на кожній пробірці знаком "+" із зазначенням часу її прояву в хвилинах і секундах.
Відсутність аглютинації позначають знаком "-".
Наявність аглютинації свідчить про присутність імунних антитіл анти-A або анти-B неповної форми, а останнє розведення, в якому воно спостерігається, - про їх титр. Оскільки непряма проба Кумбса ставиться як доповнення тільки при хибно-негативному результаті в сольовому середовищі, контроль щодо можливого хибно-позитивного результату за рахунок повних антитіл проводити немає необхідності.
У тому випадку, якщо аглютинація спостерігається у всіх пробірках, слід повторити дослідження, продовживши розведення сироватки.
Негативний результат у всіх пробірках свідчить про відсутність імунних антитіл неповної форми в даній порції досліджуваної сироватки.
3. Оцінка результатів визначення аглютинуючих антитіл системи AB0
У ході вищеописаних досліджень визначають три види антитіл:
- нормальні повні антитіла-аглютиніни a(альфа) і b(бета) (термолабільні);
- імунні повні антитіла анти-A і анти-B (термостабільні);
- імунні неповні антитіла анти-A і анти-B (термостабільні).
Загальне заключення роблять на основі співставлення результатів усіх досліджень:
а) наявність імунних (термостабільних) антитіл повної або неповної форми свідчить про те, що мало місце попадання в організм людини антигену, несумісного за системою AB0. Титр цих антитіл звичайно буває нижчим, ніж нормальних повних (термолабільних) ізоантитіл a(альфа) і b(бета), найчастіше 1:8 - для імунних повних антитіл і 1:32 - для імунних неповних антитіл;
б) високий титр нормальних повних антитіл-ізоаглютинінів a(альфа) і b(бета) (a вище за 1:256 і b(бета) вище за 1:128 за даного методу дослідження) навіть за відсутності імунних термостабільних антитіл у момент дослідження свідчить про стан підвищеної сенсибілізації організму і дозволяє зробити припущення про попередні надходження антигену, несумісного за системою AB0;
в) відсутність імунних термостабільних антитіл анти-A і анти-B у разі титру нормальних антитіл a(альфа) не вище за 1:256 і b(бета) не вище за 1:128 (за даним методом дослідження) свідчить про відсутність у людини ізоімунізації груповими факторами системи AB0 до моменту даного дослідження.
Сироватки з імунними повними гемаглютинуючими антитілами від алоімунізованих донорів можуть бути використані для визначення груп крові за системою AB0 як стандартні типуючі реагенти.
4. Проба на виявлення імунних гемолізинів
Гемолізини - антиеритроцитарні антитіла класу IgG, імунної природи, які здатні активувати систему комплементу, викликаючи гемоліз еритроцитів. Найчастіше вони виявляються вперше у вагітних жінок з групою крові 0(I), коли чоловік має групу крові A(II), або B(III), або AB(IV), і тоді антитіла мають характеристику відповідно: анти-A або анти-B імунних гемолізинів. У вперше вагітних жінок з групою крові A(II) можлива поява анти-B гемолізинів (якщо чоловік має групу крові B(III) або AB(IV), Але вірогідність імунізації значно менша. Якщо вагітна має групу крові B(III), а чоловік - A(II) або AB(IV), то можлива поява
анти-A імунних гемолізинів, але ще з меншою вірогідністю.
У лабораторних умовах гемолізини виявляють шляхом реакції досліджуваної сироватки з тест-еритроцитами в присутності комплементу (проба на виявлення гемолізинів є комплементзалежною реакцією).
4.1. Обладнання та реагенти
4.1.1. Обладнання: пробірки скляні, пастерівські піпетки, вата, штативи лабораторні, термостат, центрифуга ЦКЛ, холодильник побутовий, водяна баня.
Реагенти: усе необхідне для визначення груп крові за системою AB0 (перехресним методом) та резус, досліджувана сироватка, еритроцити:
а) панель стандартних еритроцитів усіх груп крові за системою AB0;
б) еритроцити чоловіка (для вагітних) або дитини (для породіль);
в) еритроцити досліджуваної особи;
г) 0,9% розчин натрію хлориду, комплемент або щойно одержана сироватка крові як його джерело або від людини, що має AB(IV) групу крові, або від кролика або від гвінейської свинки.
Комплемент застосовують у тому випадку, коли досліджувана сироватка зберігалась більш як 48 год. до моменту дослідження, і внаслідок цього активність комплементу знизилась або зникла. Через це можливий псевдонегативний результат.
4.2. Хід дослідження
4.2.1. Спочатку визначають групову та резус-належність досліджуваної особи, а також групову належність тест-еритроцитів (донорів, чоловіка, дитини), якщо вони не відомі.
4.2.2. У штатив вміщують три ряди пробірок (відалівських або звичайних). Якщо досліджувана сироватка відноситься до 0(I) групи, тобто має ізогемаглютиніни a(альфа) + b(бета), то слід встановити 4 ряди пробірок:
1 ряд (дослід) - 10 пробірок;
2 ряд (контроль еритроцитів) - за кількістю зразків тест-еритроцитів;
3 ряд (контроль комплементу) - 1 - 2 пробірки.
Обов'язково ставлять контроль досліджуваної сироватки з тестеритроцитами донора 0(I) групи.
4.2.3. Готують 5% завис тричі відмитих еритроцитів:
а) чоловіка або дитини;
б) донорських еритроцитів 0(I), A(II), B(III) груп.
Щоб одержати 5% завис, у пробірці сполучають 0,25 мл відмитих еритроцитів з 5 мл 0,9% розчину натрію хлориду, або спрощено: 1 краплю тест-еритроцитів поєднують з 19 краплями 0,9% розчину натрію хлориду.
4.2.4. Дослідження починають з того, що в першу пробірку 1 ряду штативу вносять 3 краплі цільної сироватки, а в усі наступні - по 3 краплі ізотонічного розчину натрію хлориду.
У другу пробірку 1 ряду вносять 3 краплі цільної сироватки і починають її титрувати, переносячи з 2-ї в 3-ю пробірку по 3 краплі суміші досліджуваної сироватки з 0,9% розчином натрію хлориду і так до кінця ряду - із 3-ї в 4-ту, із 4-ї в 5-ту ..., а з останньої пробірки 3 краплі виливають. У результаті одержують розведення сироватки: цільна, 1:2; 1:4; 1:8; 1:16 і т. д. до 1:512.
4.2.5. У всі пробірки 1-го ряду вносять по 1 краплі 5% завису тест-еритроцитів (донора, чоловіка або дитини).
Під час виконання проби слід додержуватись такого правила:
- вносити краплю еритроцитів просто в сироватку, а не давати їй стікати по стінках пробірки; у такому разі можливі сліди гемолізу внаслідок підсихання еритроцитів.
4.2.6. Якщо пробу виконують з комплементом, то досліджувану сироватку прогрівають на водяній бані при температурі 56 о C протягом 30 хв., після чого титрують (п. 5.2.4), в усі пробірки додають завис еритроцитів (1 краплю) і комплемент (по 3 краплі в кожну пробірку).
4.2.7. Пробірки 2-го ряду в штативі призначені для контролю еритроцитів: 1 крапля 5% завису тест-еритроцитів + 3 краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Контролю піддають всі зразки тест-еритроцитів, що були в дослідженні.
4.2.8. Пробірки 3-го ряду - контроль комплементу. В пробірку вносять 1 краплю 5% завису тест-еритроцитів і додають 3 краплі комплементу. Контроль комплементу здійснюють на всіх зразках тест-еритроцитів, які були в дослідженні. Якщо досліджується свіжа сироватка хворого і комплемент не використовується, то 3-й ряд пробірок в штатив не ставиться.
4.2.9. 4-й ряд пробірок у штативі - обов'язковий контроль досліджуваної сироватки з тест-еритроцитами донора 0(I) групи крові. В пробірку вносять 1 краплю 5% завису тест-еритроцитів 0(I) групи крові від інтактного донора і додають 3 краплі досліджуваної суцільної сироватки.
4.2.10. Штатив струшують і ставлять у термостат при температурі 37 о C на 1 год. для інкубації.
4.2.11. Після інкубації пробірки виймають з термостата, струшують та центрифугують 1 хв. при швидкості обертання ротора від 1000 до 1500 об./хв. при кімнатній температурі.
4.3. Облік результатів реакції
Результати реакції враховують візуально за наявністю або відсутністю гемолізу. Завдяки тому, що дослідження проводили у різних розведеннях, є можливість визначити титр ізоімунних гемолізинів при позитивній реакції. Титром імунних гемолізинів вважають те розведення сироватки, де спостерігається гемоліз.
Виразність реакції (інтенсивності гемолізу) оцінюють за плюсовою системою.
Реакція позитивна (+++): на дні пробірки осаду немає, надосадова рідина інтенсивно забарвлена в червоний колір.
Реакція позитивна (++): на дні пробірки невеликий осад, надосадова рідина має значний шар забарвленої рідини.
Реакція позитивна (+): на дні пробірки осад значний, над ним тонкий шар ледве забарвленої рідини.
Реакція негативна (-): усі еритроцити знаходяться на дні пробірки, надосадова рідина незабарвлена.
Контроль: у контрольних пробірках гемолізу не повинно бути.
Якщо він є, необхідно повторити дослідження, додержуючись методики, та додатково залучити інші реагенти.
4.4. Приклад формулювання відповіді (результату аналізу)
4.4.1. У досліджуваній сироватці крові (прізвище та ініціали) виявлено імунні гемолізини до еритроцитів (чоловіка, дитини, донора - непотрібне викреслити) анти-A або анти-B в титрі... ("+" або "++" або "+++"). 4.4.2. У досліджуваній сироватці крові (прізвище та ініціали) імунні гемолізини до еритроцитів (чоловіка, дитини, донора - непотрібне викреслити) анти-A або анти-B не виявлено.